172216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavulánsav és sói elkülönítésére
27 172216 28 Klavulánsav-benzilészter előállítása A 16. példában ismertetett módon kapott 3,3 kg súlyú szilárd anyagot (ß-laktamäz inhibitálási módszerrel meghatározva 69,4 g klavulánsavat tartalmaz) 5,5 liter dimetil-formamidban szuszpendálunk, majd a szuszpenzióhoz 500 ml benzil-bromidot adunk. Szobahőmérsékleten 2 órán át végzett keverés után a szuszpenzióhoz 12 liter etil-acetátot adunk, majd a szilárd anyagokat kiszűrjük. A szűrletet vákuumban bepároljuk, amikoris 212 g mennyiségben olajos anyagot kapunk. Ezt az anyagot ciklohexánnal felvisszük egy 100 mm x 325 mm méretű, szilikagélből (a Hopkins & Williams Romford-i, nagy-britanniai cég MFC jelzésű terméke) készült oszlopra, majd az oszlopot 12 liter ciklohexánnal eluáljuk a reagálatlan benzil-bromid elkülönítésére. Az eluálást ezután etil-acetáttal folytatjuk 500 ml-es frakciókat gyűjtve. Ezek észtertartalmát azután megvizsgáljuk úgy, hogy a frakciókból egy-egy cseppet szilikagéllel bevont vékonyrétegkromatográfiás lemezekre (a Merck cég ún. előrebevont Silica gel 60 F 254 jelzésű lemeze), majd a lemezeket TTC sprayt használva bepermetezzük. Az intenzív vörös foltot adó frakciókat tovább vizsgáljuk szilikagél-lemezeken vékonyrétegkromatográfiásan, eluálószerként kloroform és etil-acetát 8 : 2 arányú elegyét használva és az előhívást TTC-vel végezve. Az 5—13. frakciók tartalmazzák a kívánt észter zömét, így ezeket összeöntjük, majd vákuumban bepároljuk, amikoris 79,3 g mennyiségben olajat kapunk. Ezt azután egy 100 mm x 450 mm méretű, szilikagéllel (a Merck cég „silica gel H type 60” jelzésű terméke) készült oszlopon kromatografáljuk eluálószerként kloroform és etil-acetát 8: 2 arányú elegyét használva. Az előzőekben ismertetett módon az észtert tartalmazó frakciókat kiválasztjuk, majd összeöntjük és bepároljuk, amikoris 45,9 g mennyiségben olyan olajat kapunk, amely NMR-spektruma alapján 62%-os tisztaságúnak bizonyul. Ezt a terméket azután egy 68 mm x450 mm méretű, Sephadex LH 20 jelzésű gyantával (a Sephadex LH 20 a Sephadex 0,25 jelzésű gyanta hidroxilpropil-származéka; a Pharmacia Great Britain londoni, nagy-britanniai cég szállítja) töltött oszlopon eluálószerként ciklohexán és kloroform 1: 1 arányú elegyét használva kromatografáljuk. Az aktív frakciók kiválasztása, összeöntése és bepárlása útján 27,6 g mennyiségben színtelen olajat kapunk, amely az elvégzett NMR vizsgálat tanúsága szerint 95%-os tisztaságú klavulánsav-benzilészter. E terméket szabad klavulánsav vagy klavulánsavsó előállítására használjuk. 23. példa Klavulánsav-benzilészter előállítása 150 liter, 7-es pH-jú és 16,2 g klavulánsav-nátriumsót tartalmazó fermentlevet szűrése után 5 kg Amberlyst A 26 jelzésű kloridformájú anioncserélő gyantával (Rohm & Haas Company philadelphiai, amerikai egyesült államokbeli cég terméke) keverünk szobahőmérsékleten 1 órán át, majd a gyantát kiszűijük és a szűrletben a klavulánsavtartalmat meghatározzuk. A meghatározás tanúsága szerint a gyantán 6,4 g klavulánsav adszorbeálódott. A gyantát ezután 20 liter ionmentes vízzel. 22. példa 20 liter acetonnal és 10 liter dimetil-formamiddal mossuk, ezután pedig 2,3 liter 0,2 mólos dimetil-formamidos nátrium-jodid-oldatban szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz ezt követően 200 ml benzil-bromidot adunk, majd a szuszpenziót keveréssel alaposan homogenizáljuk. A szuszpenziót ezután 16 órán át állni hagyjuk, majd 2 liter etil-acetátot adunk hozzá, a gyantát kiszűrjük és többször etil-acetáttal mossuk, végül pedig a szűrlettel a mosófolyadékokat összeöntjük. Az így kapott etil-acetátos oldatot ezután kis térfogatra betöményítjük, majd egy 75 mm x 450 mm méretű, szilikagéllel (Merck cég „Silica gel H type 60” jelzésű terméke) töltött oszlopon eluálószerként etil-acetát és ciklohexán 8 : 2 arányú elegyét használva kromatografáljuk. Az aktív, vagyis a klavulánsav-benzilésztert tartalmazó frakciókat a 24. példában ismertetett módon vékonyrétegkromatográfiásan kiválasztjuk, majd összeöntjük és 20 ml-re betöményítjük. A betöményített oldatot egy 42 mm x 450 mm méretű, az előző kromatografálásnál említett minőségű szilikagéllel töltött oszlopon eluálószerként kloroform és etil-acetát 8 : 2 arányú elegyét használva kromatografáljuk. A célterméket tartalmazó frakciókat összeöntjük, majd bepároljuk, amikoris 440 mg mennyiségben színtelen olajat kapunk, amely NMR spektrumának tanúsága szerint 90%-os tisztaságú klavulánsav-benzilészter. E terméket szabad klavulánsav vagy klavulánsavsó előállítására használjuk. 24. példa S. clavuligerus tenyésztése útján kapott, szűrt fermentléből nyert nyers extraktumból klavulánsav-benzilészter előállítása A 14. példában ismertetett módon a szűrt fermentlé butanolos extrahálása, majd ezen extraktum vízzel végzett extrahálása útján kapott extraktum egy aliquotját Edwards-féle kamrás szárítóval fagyasztva szárítjuk, majd az így kapott szilárd anyagból 24 g-ot — amely a p-laktamáz inhibitálási vizsgálat tanúsága szerint 0,96 g klavulánsav-nátriumsót tartalmaz — 75 ml vízmentes dimetil-formamidban szuszpendálunk, a szuszpenzióhoz pedig 75 ml benzil-bromidot adunk. A reakcióelegyet ezután szobahőmérsékleten 2 órán át keverjük, majd 500 ml etil-acetáttal hígítjuk és szűrjük. A szűrletet vákuumban forgó bepárlóban bepároljuk, majd a kapott olajos maradékot ciklohexánnal felvisszük egy 50 mm x 350mm méretű, szilikagéllel („Biogel Biosil A 100” jelzésű termék) töltött oszlopra. A benzil-bromidot ciklohexánnal eluáljuk, majd az eluálást etil-acetáttal folytatjuk 10 mles frakciókat gyűjtve. A klavulánsav-benzilésztert tartalmazó frakciókat a 22. példában ismertetett módon kiválasztjuk, összeöntjük, majd a 22. példában részletezett módon oszlopkromatográfiásan továbbtisztítjuk. Így 220 mg tiszta klavulánsav-benzilésztert kapunk. E terméket szabad klavulánsav vagy klavulánsavsó előállítására használjuk. 25. példa Klavulánsav-nátriumsó előállítása (B reakcióvázlat) 281 mg gyakorlatilag tiszta klavulánsav-benzilészter 25 ml etanollal készült oldatához 82 mg nátrium-hidrogén-karbonátot és 90 mg, 10% fémpalládiumot tartal-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
