172216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavulánsav és sói elkülönítésére
23 172216 24 A keveréket ezután betápláljuk szivattyúval 2 1/perc térfogati sebesség tartása mellett egy folyadék—folyadék centrifugális szeparátorba (Sharpies M35Py—5PH modell, gyártja a Pennwalt Ltd., Camberley, Sussex, Nagy- Britannia) a vizes fázis elkülönítésére. A fenti módon 1800 liter szűrt fermentléből 90 1 vizes fázist kapunk, amely a fermentlé eredeti klavulánsavtartalmának 39%-át tartalmazza. Ebből a vizes fázisból 15 literben a szárazanyagtartalmat 2%-ról 8/ó-ra növeljük literenként 60 g nátrium-klorid beadagolása útján, majd az így kapott oldatot porlasztva szárítjuk az Anhydro koppenhágai dán cég Láb S 1 típusú berendezését alkalmazva. A porlasztásos szárítás paraméterei az alábbiak: a kiindulási oldat betáplálási aránya 2 1/óra, a porlasztó üzemeltetési feszültsége 170 V, továbbá a szárítóközeg aránya 3—7, belépő hőmérséklete 150 °C és kilépő hőmérséklete 80 °C. Az 1 kg összsúlyú szárított termék a berendezésbe betáplált oldat klavulánsav-tartalmának 62%-át tartalmazza. A fenti vizes fázis visszamaradt 75 liternyi részét ultraszűrés útján (az alkalmazott berendezés a De Danske Sukkerfábrikker dán cég Laboratory Module nevű, 900-as típusú membránnal felszerelt készüléke) koncentráljuk. A készülékkel úgy dolgozunk, hogy a töményítendő oldatot olyan, rozsdamentes acélból készült tartályból recirkuláltatjuk, amely hűtőrendszerrel van ellátva és ugyanakkor a készülék kilépő folyadékszelepét úgy állítjuk be, hogy a készülékben levő 40 membránon 25 at nyomáskülönbség mutatkozzon. A keringtetett folyadék hőmérsékletét 2—5 °C-on, pH-ját pedig szükséges esetben 2 normál sósavoldatot adagolva 6,8 ±0,1 értékre tartjuk. Az eredeti 75 liter térfogatot így 34 literre csökkentjük, a 34 liternyi oldat pedig az eredeti 75 liternyi oldat klavulánsav-tartalmának 72%-át tartalmazza. A kapott vizes koncentrátumot ezután mintegy 5 °C- on tároljuk, majd szárazanyagtartalmát 8%-ra beállítjuk és a korábban ismertetett módon porlasztva szárítjuk. A 90 liternyi vizes fázisból porlasztásos szárítás útján összesen kapott termék 69,4 g klavulánsavat tartalmaz, ami megfelel a porlasztásos szárításhoz összesen betáplált oldatban levő klavulánsavtartalom 72%-ának, illetve az 1800 liternyi szűrt fermentlében levő klavulánsavtartalom 21%-ának. 17. példa Nyers klavulánsav-nátriumsó részleges tisztítása A 15. példában ismertetett módon elkülönített nyers klavulánsav-nátriumsót ioncserélő kromatográfia útján tisztítjuk. A 15. példában kapott anyagból — amelynek I50 értéke végső koncentrációban 1,3 ug/ml — 18 g-ot feloldunk 25 ml desztillált vízben, majd a kapott oldatot felvisszük klorid-formájú Permutit FF IP (SRA 62) gyantából készült, 38 mm x 380 mm méretű oszlopra. Az oszlopot gradienseluálásnak vetjük alá úgy, hogy gravitációs úton 0,5 mólos nátrium-klorid-oldatot táplálunk be 1 liter desztillált vizet tartalmazó keverőtartályba, amelyből az eluáló folyadék az oszlopba jut. 10 ml-es frakciókat veszünk el és a frakciók 1/2500-szoros hígításának aktivitását a (3-laktamáz inhibitálási vizsgálatban meghatározzuk. A 24. és a 30. frakció között megjelenő fő színes sáv után eluálódnak az aktív frakciók. Ezeket összeöntjük, majd 30 ml térfogatra betöményítjük. Az így kapott oldatot 51 mm x 430 mm méretű, Bio Gel P2 gyantával töltött oszlopon eluálószerként 1%-os vizes n-butanol-oldatot használva sómentesítjük. A 20 ml-es frakciókat S-laktamázt inhibitáló aktivitásukra megvizsgáljuk. A frakciókból ugyanakkor egy-egy cseppet papírcsíkokra cseppentünk, majd a cseppeket a 3. kimutatási módszernél ismertetett módon Ehrlich-reagenssel vagy trifenil-tetrazólium-klorid reagenssel bepermetezzük. A S-laktamáz inhibitálási aktivitás összhangban áll az ezekkel a reagensekkel megjelenített rózsaszínű, illetve vörös foltokkal. A nátrium-kloridot nem tartalmazó aktív frakciókat összeöntjük, majd vákuumban szárazra pároljuk. így 520 mg részben tisztított klavulánsav-nátriumsót kapunk, amelynek I50 értéke 0,2 ug/ml. Ezt az anyagot szilikagélen vékonyrétegkromatográfiásan vizsgálva az alábbi Rf értékeket kapjuk: futtatószerként n-butanol, etanol és víz 4: 1: 5 arányú elegyének felső fázisát használva az Rf érték 0,37; futtatószerként n-butanol, ecetsav és víz 12: 3: 5 arányú elegyét használva az Rf érték 0,44; és futtatószerként izopropanol és víz 7: 3 arányú elegyét használva az Rf érték 0,78. A klavulánsav zónáit Ehrlich-reagenssel végzett bepermetezés útján hívjuk elő. Jelzőanyagként egyidejűleg 6-amino-penicillánsavat futtatunk, amelynek Rf értéke ugyanezen reagenssel előhíva és ugyanezen futtatószereket használva 0,38, 0,39, illetve 0,77. 18. példa Klavulánsav-nátriumsó részleges tisztítása A 12. példában kapott fermentlét szűrés után a 14. példában ismertetett módon oldószeres extrakciónak vetjük alá, majd a kapott szilárd anyagot tovább tisztítjuk ioncserélő kromatográfiával Whatman dietilaminoetil-cellulóz DE 52 (gyártja a Whatman Co. amerikai egyesült államokbeli cég) gyantát használva. Közelebbről úgy járunk el, hogy a kapott szilárd anyagból 10 g-ot feloldunk 20 ml desztillált vízben, majd az így kapott oldatot felvisszük egy 38 mm x 500 mm méretű, DE 52 gyantából készült oszlopra, amelyet előzetesen 0,01 mólos és 7,5 pH-jú foszfátpufferrel ekvilibráltunk. Az oszlopot ezután gradienseluálásnak vetjük alá úgy, hogy 0,1 mólos 7,5 pH-jú és 0,01 mólos foszfátpufferrel készült nátrium-klorid-oldatot vezetünk egy, 7,5 pH-jú és 0,01 mólos foszfátpufferből 1 litert tartalmazó keverőkamrába, amely össze van kötve az oszloppal. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk, majd a frakciók p-laktamázt inhibitáló aktivitását 1/2500-szoros hígításban meghatározzuk. A frakciókat ugyanakkor megvizsgáljuk baktériumelleni hatásukra nézve az úgynevezett üreg-a-lemezben vizsgálati módszerrel Klebsiella aefogenes mikroorganizmussal beoltott agar-agar lemezeket használva (lásd a 2. kimutatási módszert). A legmagasabb (3-laktamáz inhibitálási aktivitását mutató és üreg-a-lemezben vizsgálati inhibitálási zónákat adó frakciókat összeöntjük, majd a kapott elegyet betöményítjük és Bio Gél P2 gyantából készült oszlopon sómentesítjük. Ezek a frakciók az elvégzett papírkromatográfiás és vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatok tanúsága szerint klavulánsavat tartalmaznak. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
