172216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavulánsav és sói elkülönítésére
21 172216 22 13. példa Streptomyces clavuligerus tenyésztése Oltótenyészet készítésére alkalmas lombikban oltótenyészetet készítünk a korábbiakban ismertetett módon táptalajként a 3. példában ismertetett táptalajt használva, amelynek pH-ját a tenyésztés előtt 7,0-ra beállítjuk. Az így kapott oltótenyészettel 5% arányban beoltunk 500 ml-es kúpalakü lombikokba töltött 100— 100 ml-es aliquotokat az alábbi összetételű, ionmentes vízzel készült és sterilizált táptalajból. Prichem P2241 1 vegyes% Arkasoy 50 1,5 vegyes" ;', kálium-dihidrogén-foszfát 0,1 vegyes% A táptalaj végső pH-értékét 7,0-ra állítjuk be. A beoltott lombikokat 26 °C-on rázatjuk. Az optimális ß-laktamáz inhibitálási aktivitás 3—5 napon belül érhető el. Ekkor a fermentlé 300—500 [xg/ml klavulánsavat tartalmaz. 14. példa Nyers klavulánsav-nátriumsó elkülönítése A 10. példában kapott fermentlét folyamatosan centrifugáljuk a micélium elkülönítésére, a micéliumot pedig eldobjuk. 150 liter fermentléből így 120 liter derített fermentlét kapunk. Ennek a szűrletnek [í-laktamáz inhibitálási aktivitása 1/2500-szoros hígításban 58%. A szűrletet ezután 5 °C-ra lehűtjük, majd 40 liter n-butanolt adunk hozzá. A kapott keverékhez keverés közben 25/,',os kénsavoldatot adunk, míg pH-ja 2,0 lesz. A megsavanyított keveréket ezután 10 percen át keverjük, majd a fázisokat elválasztjuk, a vizes fázist kiöntjük. A kapott n-butanolos fázishoz 0,5% mennyiségben Norit G SX márkanevű aktívszenet adunk, majd az így kapott keveréket 15 percen át keverjük. Ezután a keveréket diatomaföldön szűrjük, a szűrlethez térfogatának egynegyed részét kitevő ionmentes vizet adunk, majd a kapott keverékhez keverés közben annyi 20%-os nátrium-hidroxid-oldatot adunk, míg pH-ja 7,0-ra beáll. A fázisokat ezután centrifugálással elválasztjuk, az n-butanolos fázist pedig kiöntjük. A vizes fázist ezután csökkentett nyomáson 800 ml-re bepároljuk, majd a koncentrátumot fagyasztva szárítjuk. így 35 g nyers sót kapunk, amelynek I5o értéke 1,3 [i.g/ml a ß-laktamäz inhibitálási vizsgálatban meghatározva. Ezt a szilárd készítményt ezután száraz helyen —20 C-on tároljuk további tisztításáig. 15. példa Nyers klavulánsav-nátriumsó elkülönítése 12. példában kapott és 1/2500-szoros hígításban 53%os aktivitást mutató fermentléből 1 litert átbocsátunk egy, 25,4 mm átmérőjű és 152,4 mm hosszú, klorid formájú Permutit Isopore FF IP (SRA 62) márkanevű gyantából [a gyanta gyártója a Permutit Co. Ltd. 1A Prichem P224 65 % óla jaavat, 11 % palmitinsavat és hasonló sava*at tartalmazó triglicerid, szállítója a Prices Limited (Wirral, Cheshire) oagy-britanniaí cég. (Isleworth, Middlesex), nagy-britanniai cég] készült oszlopon, majd az oszlopot 300 ml desztillált vízzel mossuk. A hatásos ß-laktamäz inhibitor eluálását 0,2 mólos nátrium-klorid-oldattal végezzük. 20 ml-es frakciókat gyűjtünk és 1 /2500-szoros hígításban meghatározzuk aktivitásukat. Az aktív frakciókat összeöntjük, majd vákuumban 20 ml-re betöményítjük. Az így kapott oldatot sómentesítjük Bio Gel P2 márkanevű gyantán [a Bio Gél P2 gyantát a Bio Rád Laboratories (Richmond, Kalifornia) amerikai egyesült államokbeli cég szállítja], közelebbről egy 38,1 mm átmérőjű oszlopon, 386 mm-es gyantaággyal, az oszlopot 1%-os vizes n-butanol-oldattal eluálva. Az aktív frakciókat — ß-laktamäzt inhibitáló aktivitásuk alapján szelektálva — összeöntjük. A nátrium-klorid a klavulánsav után eluálódik és ezüst-nitrát-oldatot használva mutatható ki. Az egyesített aktív frakciókat betöményítjük, majd fagyasztva szárítjuk. Egy liter szűrt fermentléből kiindulva a fentiekben ismertetett módon 0,45 g nyers klavulánsav-nátriumsót kapunk, mely anyag I50 értéke 0,92 [t.g/ml. Ezt a csapadékot további tisztításig —20 °C-on tároljuk. 16. példa Nyers klavulánsav-nátriumsó elkülönítése 300 [J.g/ml klavulánsavat tartalmazó szűrt fermentlét hosszanti elrendezésű keverőrendszert használva megsavanyítunk, majd n-butanollal extrahálunk és a klavulánsavat visszaextraháljuk vízbe semleges pH-értéken. 5—10 °C hőmérsékletre lehűtött szűrt fermentlét betáplálunk egy hosszanti elrendezésű keverőbe, amelynek beömlő nyílásán ugyanakkor elegendő mennyiségű 6 térfogat%-os salétromsavoldatot táplálunk be ahhoz, hogy a kilépő elegy pH-ját 2,0 ±0,1 értéken tartsuk. A savanyú elegyet ezután 4,1 1/perc térfogatsebességgel glikollal hűtött lemezes hőcserélőn (gyártó cége az A. P. V. Ltd.,* bocsátjuk keresztül hőmérsékletének 2—5 °C- on tartására. A lehűtött savanyú elegy pH-értékét vizsgáló cellában folyamatosan rögzítjük, mielőtt az elegyet betáplálnánk egy háromlépcsős ellenáramú szeparátorba (EG 1006 számú modell, gyártó cége a Westfalia Separators Ltd.,** Az ellenáramú szeparátorba ugyanakkor 3 1/perc térfogatsebességgel mintegy 5 °C-ra lehűtött és n-butanollal telített vizet táplálunk be. Az ellenáramú szeparátorból kifolyó vizes fázist a csatornahálózatba vezetjük. A n-butanolos fázisban levő vizet ugyanakkor folyadék—folyadék centrifugális szeparátort (3024X—G modell, gyártó cége az Alfa Laval Ltd. svéd cég) alkalmazva elkülönítjük, az n-butanolos oldatot pedig rozsdamentes acélból készült és hűtőköpennyel felszerelt tartályban gyűjtjük, hőmérsékletét mintegy 5 °C-on tartva. A tartályból 40 literes aliquotokat veszünk el, majd alaposan összekeverjük 2 liter, 5 °C-ra lehűtött és n-butanollal telített vízzel. Az így kapott keverék pH-értékét pH 6,8 ±0,1 értékre beállítjuk 20%-os nátrium-hidroxid-oldatot használva. * Crawley, Sussex, Nagy-Britannia). ** Old Woivertofi, Milton Keynes, Nagy-Britanma). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
