172216. lajstromszámú szabadalom • Eljárás klavulánsav és sói elkülönítésére
3 172216 4 ß-laktamdz hatását gátló komponensét szinergistának nevezik és a szinergistákat rendkívül értékesnek tekintik, minthogy növelik a penám-karbonsavszármazékok és cefem-karbonsavszármazékok baktériumelleni hatását rezisztens mikroorganizmusokkal szemben. A találmány kidolgozása során így célul tűztük ki megfelelő szinergisták kikísérletezését. A ß-laktamäz hatását inhibitáló és penám-karbonsavakkal, illetve cefem-karbonsavakkal szinergistaként ható bizonyos, fi-laktamázzal szemben ellenállóképes félszintetikus cefem-karbonsavszármazékokat és penámkarbonsavszármazékokat már ismertettek a szakirodalomban flásd például: Sutherland és munkatársai: Nature, 201, 868 (1964); Sabath és munkatársai: Nature, 204, 1066 (1964); O’Callaghan és munkatársai: Antimicrob. Agents and Chemoterapy, 1968, 61 (1969)]. Ezek az ismert szinergisták azonban a hatóanyagkeverékben levő másik antibiotikum hatásspektrumát rendkívüli mértékben szűkítik. A szakirodalomból ismertek továbbá olyan Actinomyces tenyészetek, amelyek ß-laktamäzt inhibitáló anyagokat termelnek és ezek az anyagok ugyanakkor szinergikusan hatnak penám-karbonsavszármazékok kai és cefem-karbonsavszármazékokkal. Ilyen tenyészeteket ismertetnek többek között az 1 363 075 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban, továbbá Hata és munkatársai a J. Antibiotics, 25, 473 (1972) irodalmi helyen, valamint Umezawa és munkatársai a J. Antibiotics, 26, 51 (1973) irodalmi helyen. Ezek közül az actinomycetális eredetű ß-laktamäz inhibitorok közül egyiket sem alkalmazták azonban a klinikai gyakorlatban. Az actinomycetális eredetű ß-laktamäz inhibitoroktól az alábbiakban ismertetendő, a találmány szerinti klavulánsavat közelebbről az különbözteti meg, hogy a tenyészetből pH 2-nél szerves oldószerekkel extrahálható, emberi vérben igen stabil, baktériumelleni és ß-laktamäz inhibitáló hatásának spektruma igen széles, molekulasúlya alacsony és különböző futtatószerekkel végzett papírkromatográfiás vizsgálatban Rf értéke nagy. Azt találtuk, hogy Streptomyces clavuligerus ismert módon végzett tenyésztése, azaz hagyományos összetételű táptalajon végzett 25—30 °C-on durván semleges körülmények között végzett aerob tenyésztés útján a ß-laktamäz hatását inhibitáló anyag képződik, amely baktériumelleni aktivitást is mutat. Ezt az új anyagot klavulánsavnak neveztük el. A klavulánsav az alábbi tulajdonságokkal rendelkezik: 1. A klavulánsav karbonsav. 2. A klavulánsav nátriumsót képez, amelynek infravörös spektruma az 1. ábrán látható (a spektrum vízszintes tengelyének egysége a hullámszám, a függőleges tengelyen az áteresztés van megadva; a felvétel kálium-bromid pasztillában készült; a só koncentrációja a pasztillában 0,4 súly%). 3. A klavulánsav képes a Staphylococcus aureus specieshez tartozó törzsek növekedését gátolni. 4. A klavulánsav képes szinergetikusan fokozni az ampicillin baktériumelleni hatását az Escherichia coli, Klebsiella aerogenes és Staphylococcus aureus speciesekhez tartozó, ß-laktamäzt termelő törzsekkel szemben. 5. A klavulánsav képes szinergetikusan fokozni a cefaloridin baktériumelleni hatását a Proteus mirabilis és Staphylococcus aureus speciesekhez tartozó, ß-laktamäzt termelő törzsekkel szemben. 6. A klavulánsav metilésztert képez, amelynek tömegspektrometriásan meghatározott mólsúlya 213,0635, ami a C9H, ,NOj összegképletnek felel meg. 7. A klavulánsav infravörös spektrumának, illetve magmágneses rezonanciaspektrumának jellegzetes adatai az alábbiak : vm.ls(CHCl3): 3330, 3010, 1800 és 1710 cm“1. NMR[(CD3)2SO]: 3,0 (1H, d, J = 17Hz, 6ß-C/7), 3,55 (1H, dd, J= 17 és 3 Hz, 6a-CH), 3,97 (2H, d, J=7 Hz, CH2OH), 4,68 (1H, t, J = 7 Hz, =C//CH2OH), 4,92 (1H, s, 3-CH), 5,61 (1H, d, J=3 Hz, 5-CH) és 6,0—10,0 (széles s, OH, C02H). így a klavulánsav C8H9N05 összegképletü, olyan egybázisú karbonsavnak tekinthető, amely nátriumsója formájában az 1. ábrán bemutatott jellegzetes infravörös abszorpciós spektrumot mutatja. A Streptomyces clavuligerus által termelt és a fentiekben ismertetett tulajdonságokat mutató vegyület a II képlettel jellemezhető, vagyis a klavulánsav szabatos kémiai megnevezése 3-(ft-hidroxi-etilidén)-7-oxo-4-oxa-1 -aza-biciklo[3,2.0]-heptán-2-karbonsav. A klavulánsav 5- és 2-helyzetű szénatomjának sztereokémiája megegyezik a természetes penám-karbonsavakéval és cefem-karbonsavakéval, így a klavulánsav pontosan az I szerkezeti képlettel jellemezhető. így viszont a klavulánsav szabatosabb kémiai megnevezése Z-(2R,5R) -3-(ß-hidroxi-etilid0n)-7-oxo-4-oxa-l-aza-biciklo-[3.2.0]heptán-2-karbonsav. Azt találtuk továbbá, hogy a klavulánsav és gyógyászatilag elfogadható sói a fermentálás során kapott, klavulánsavsót tartalmazó nyers vagy részlegesen tisztított fermentléből úgy különíthetők el, hogy azt először egy anioncserélő anyaggal érintkeztetjük, majd az anioncserélő anyagból a klavulánsavsót kromatográfiásan eluáljuk eluálószerként egy elektrolit, előnyösen egy alkálifém- vagy alkáliföldfém-klorid oldatát használva, ezután a klavulánsavsó és az elektrolit így kapott oldatából az elektrolitot ismert módon elválasztjuk, a klavulánsavsó így tisztított oldatából a klavulánsavsót ismert módon elkülönítjük, és ezután kívánt esetben a kapott sóból a szabad savat ismert módon felszabadítjuk. A klavulánsav rendkívül hasznos volta rögtön felismerhető, ha figyelembe vesszük, hogy a Klebsiella aerogenes A specieshez tartozó bizonyos törzsek növekedését [mely törzsek növekedését 125 p.g/ml koncentrációban az ampicillin, az amoxicillin, a karbenicillin vagy a benzilpenicillin, illetve 10 p.g/ml koncentrációban a klavulánsav nem gátolja] a zárójelben említett penám-karbonsavak már 12,5 p.g/ml-nél kisebb koncentrációban gátolják, ha a rendszerben 5 jjig/ml klavulánsav is jelen van. Hasonló eredmények figyelhetők meg olyan kombinációk alkalmazása esetében is, amelyek a klavulánsav különböző észtereit tartalmazzák. így például a Klebsiella aerogenes A specieshez tartozó törzsek növekedését [a növekedést 125 p.g/ml koncentrációban az ampicillin vagy 10 p.g/ml koncentrációban a klavulánsav-metilészter nem gátolja] az ampicillin már 12,5 fxg/ml-nél kisebb koncentrációban gátolja, ha a rendszerben 5 txg/ml koncentrációban klavulánsav-metilészter is jelen van. Hasonló módon azt találtuk, hogy a Staphylococcus aureus (Russel) specieshez tartozó törzsek növekedését [e növekedést 100 pg/ml koncentrációban az ampicillin vagy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
