172190. lajstromszámú szabadalom • Eljárás racém 5-fenil-hidantoin hidrolizisére
3 172190 4 húspepton 10 g/liter élesztőkivonat 10 g/liter glukóz 5 g/liter NaCl 3 g/liter 5-(D,L)-metil-hidantoin 1 g/liter pH =7,2 sterilizálás 30 perc 110 C°-on. 20—24 óráig tartó, 30 C°-on való (rázatva keverés közbeni) inkubálás után a fenti előkultúrából 5 ml-t 100 ml ugyanolyan közeggel együtt inkubálunk 500 mles edényekben. 18—22 órás további inkubálás után az enzimes reakciót a megmaradó sejtekkel a következő módon vitelezzük ki: kémcsövekben levő 10 ml-nyi foszfát-pufferhez (0,07 mól, pH = 8,5), amely 20 mikromól) ml 5-(D,L)-fenil hidantoint tartalmaz, hozzáadunk 1 ml menynÿiségü baktérium-szuszpenziókat (száraz súly körülbelül 50 mg/1). 30 percig 30 C°-on történő inkubálás után p-dimetilaminobenzaldehiddel a reakciót lejátszatjuk a képződött karbamoil-származék kvantitatív meghatározására [J. Biol. Chem., 238, 3325 (1963)]. Az alkalmazott törzseket az 1. Táblázatban adjuk meg. Ezek közül azok, amelyek 942 és 945 számmal vannak ellátva, a Centralbureau voor Schimmelcultures-nál kerültek deponálásra és a CBS 145 75 és 146.75 jeleket kapták. 1. Táblázat Törzs N-karbamoilfenilglicin, mint az elméleti hozam %-a Pseudomonas sp. 940 41 941 50 942 64 943 50 Pseudomonas sp. 944 50 945 57 946 50 947 15 948 15 949 20 950 20 951 20 952 20 953 20 954 20 955 20 Pseudomonas fluorescens 956 10 Pseudomonas sp. 957 41 Pseudomonas ATCC 11299 9 Pseudomonas oleovorans CL 59 17 Pseudomonas desmolyticum NCIB 8859 25 Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 25 Pseudomonas putida ATCC 12 633 14 Az 1. Táblázatban felsorolt törzsek valamennyien nagyon jól fejlődnek a szokásos laboratóriumi közegekben. Mindnyájan képesek arra, hogy hidantoint használjanak egyedüli nitrogénforrásként. A fejlődés 5 C° és 40 C°, előnyösen 25 C° és 30 C° között megy végbe. A fajták osztályozásánál a Bergey’s Manual 7. kiadását vettük figyelembe Liszenko (J. Gen. Microbiol. 25, 379 (1961) Stanier, Pallérom és Doudoroff (J. Gén. Microbiol. 43, 159—271, 1966) ajánlásaival együtt. Azt találtuk, hogy D-hidantoin alkálikus pH-n (pH =7—10) való enzimes hidrolízisekor a megmaradó L-hidantoin nem-enzimes racemizálása végbemegy. A D(-)-N-karbamoilfenilglicin azonosságát a reakciótermék kristályosítása után IR, NMR és tömegspektrográfiás úton, valamint elemi analízissel valószínűsítettük. A fajlagos forgatóképesség: [a]o = —137° (c = 1% IN NH4OH-ban), ez az érték megfelel az irodalomban található értéknek. Az L-hidantoin racemizációja a hőmérséklet és a pH függvénye; minél magasabb a hőmérséklet és minél bázikusabb a pH, annál kedvezőbb a racemizálódás. Amennyiben 7,5 pH körül dolgozunk, a racemizálódási arány elég nagy, de nem korlátozza a reakciósebességet. Az enzimes reakció hőmérsékletét 10 C° és 60 C° között tarthatjuk. Gyakorlati okokból azonban a hőmérsékletértékeket 25 C° és 40 C° között tartjuk előnyösen. A találmány értelmében a hidantoinok hidrolízise nem csupán olyan mikroorganizmusok jelenlétében megy végbe, amelyek fejlődésben vannak vagy ezek érintetlen sejtjei jelenlétében, de lejátszódik a fenti mikroorganizmusok kivonatai hatására is. A mikroorganizmusok tenyészthetők például folyékony tápközegben, így a hidroláz felhalmozódik a sejtekben és a DL-hidantoin hozzáadható a tenyészethez. Az enzimes reakció kivitelezhető az úgynevezett maradék-sejtekkel is. Ebben az esetben a baktériumsejteket kinyerjük a tápközegből, mossuk és megfelelő puffer-oldatban szuszpendáljuk, amelyhez azután hozzáadjuk a racém hidantoint. Ezenkívül olyan készítmények használata is lehetséges, amelyek hidrolázokat, így ezek kivonatait vagy koncentrátumait, olyan nyers vagy tisztított hidrolázkészítményeket, amelyek a fent felsorolt mikroorganizmusok sejtjeiből kaphatók, tartalmaznak. A találmány részleteit a példák még szemléletesebben is bemutatják, ezek a példák csupán a találmány megvilágosítására szolgálnak. 1. példa Egy 500 ml-es edényben a Pseudomonas sp. 942 CBS 145.75 törzs fent ismertetett közegében levő 100 ml táptalajhoz a 30 C°-on történő inkubálás (rázatva keverés) 24. órájában hozzáadunk 100 ml olyan foszfátpuffért (0,14 mól, pH =8,5), amely 30 mikromól/ml 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmaz. Ugyanazon körülmények között az inkubálást még 5 óra hosszat folytatjuk és a képződött N-karbamoil-fenil-glicint meghatározzuk. 530 mg 5-(D,L)-fenil-hidantoinból 525 mg N-karbamoil-fenil-glicin képződik, amely körülbelül 90%-os kitermelésnek felel meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
