172190. lajstromszámú szabadalom • Eljárás racém 5-fenil-hidantoin hidrolizisére
5 172190 6 2. példa A fenti összetételű táptalajt készítjük el, amely 1 g/liter 5-(D,L)-metil hidantoint tartalmaz. A pH-t nátrium-karbonáttal 7,2-re állítjuk be és az 5 anyagot 50 ml-es adagokban 250 ml-es edényekbe szétosztjuk. Ezeket 110 C°-on 30 percig sterilizáljuk és az edények tartalmát beoltjuk egy ferde-tenyészetből származó Pseudomonas sp. 942 CBS 145.75 kultúrával, amely ugyanazt a közeget tartalmazza 2% agarral 10 (DIFCO) és az egészet rázatás mellett (220 ford/perc) 30 C°-on 20 óra hosszat inkubáljuk. Ezzel az előkultúrával (optikai sűrűség 550 mm-nél 0,400, hígítás: 1 : 10) 500 ml-es edényekben beoltunk 100 ml ugyanolyan közeget, mint amilyet már használ- 15 tunk, a beoltáshoz 5-5 ml előkultúrát használunk, majd az egészet rázatás mellett (220 ford/perc) 30 C°-on 18 óra hosszat inkubáljuk (a funkciós növekedés utolsó fázisa). Ezután a sejteket centrifugálással (5,000 g, 20 perc) elkülönítjük, háromszor mossuk puíferolt fizio- 20 lógiás sóoldattal és végül foszfátsó-pufiferben szuszpendáljuk (pH =8,5, 0,07 mólos): ezek a maradék sejtek. Enzimes hidrolízisre 30 C°-on rázatás közben (220 ford/perc) 250 ml-es edényekben 64 ml-nyi reakcióelegyeket, amelyek 260 mg baktériumot (száraz súly) 25 és 20 mikromól/ml D,L-5-fenil-hidantoint ( = 3,52 mg/ml) tartalmaznak, inkubálunk. Különböző időközökben a hidrolízis-termékeket, például a D-karbamoil-fenil-glicint, kolorimetriás méréssel meghatározzuk 438 nm-nél [J. Biol. Chem. 238, 3325 (1963)]. Az 1. ábra 30 mutatja az eredményeket, mégpedig az elméleti hozam százalékában a karbamoil-származékokat. Az abszcisszára az időt (órákban), az ordinátára pedig a képződött D(-)-N-karbamoil-fenil-glicin százalékos mennyiségét vittük fel. 35 3. példa A következő félszintetikus közeget készítjük el, amely- 40 nek az összetételét az alábbiakban adjuk meg: Na2HP04 kh2po4 (NH4)2S04 MgS04 MnS04 FeS04 • 7H20 glukóz élesztőkivonat 5-(D,L)-metil hidantoin 7.05 g/liter 2,72 g/liter 5.0 g/liter 45 0,2 g/liter 0,45 mg/liter 5.5 mg/liter 10 g/liter 0,2 g/liter 50 1.0 g/liter A közeget 50 ml-es adagokban 250 ml-es edényekbe elosztjuk, egyrészét pedig 100 ml-es adagokban 500 ml-es edényekbe tesszük és az egészet 110 C°-on sterili- 55 záljuk 30 percig. Előkultúrához a 250 ml-es edényeket beoltjuk ferde kultúrából származó Pseudomonas sp. 942 CBS 145./5 törzs tenyészetével és az inkubálást a 2. példában leírt módon végezzük 24 óra hosszat 30 C°-on. 60 Ebből a tenyészetből (optikai sűrűség 550 nm-nél 0,245, hígítás: 1: 10) 5 ml-nyi mennyiségeket beoltunk az 500 ml-es edényekbe. Ezeket azután 19 óra hosszat a fenti módon 30 C°-on inkubáljuk és a maradék sejteket a 2. példában megadott módon készítjük. 65 Enzimes hidrolízist végzünk 30 C°-on olyan reakcióelegyben, amely 64 ml pulferben 280 mg baktériumot (száraz súlyra számítva) és 20 mikromól/ml 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmaz. Ezután 5, 10 és 15 perc elteltével meghatározzuk a képződött karbamoil-származékot. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze. 2. Táblázat Idő percekben 5 mikromól/ml képződött karbamoil-származék 1,15 10 15 2,05 3,00 4. példa A 2. példában leírt módon készítjük elő a Pseudomonas sp. 942 CBS 145.75 törzs baktériumsejtjeit. Ezeknek a szuszpenzióját (42 mg/ml száraz sejt), amelyet foszfátsó-pufferrel (0,1 mólos, pH =8) állítunk elő, mechanikusan megtörjük egy „Manto-Gaulin” homogenizátorral, amely 850 kg/cm2 nyomáson és 24 C° alatti hőmérsékleten működik. A sejthulladékot centrifugálással elkülönítjük a kivonattól (25,000 g, 30 perc). 950 ml foszfátsó-pufferhez, amelynek a pH-ja 7,7 és amely 2,12 g 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmaz, hozzáadunk 50 ml olyan kivonatot, amely 8,500 egységnyi enzimet tartalmaz. (1 egység az az enzimmennyiség, amely 30 C°-on olyan foszfát-pufferben, amelynek a pH-ja 7,7 és amely 12 mikromól/ml 5-(D,L)-fenil-hidantoint tartalmaz, 1 mikromól/ml anyagot alakít át 60 perc alatt). 1 óra alatt 30 C°-on 1,7 g D-karbamoil-származék keletkezik, amely a teljes hidrolízis körülbelül 80%-ának felel meg. 5. példa A 4. példában leírtakhoz hasonlóan 993 ml anyaghoz hozzáadunk 7 ml olyan kivonatkészítményt, amelyet körülbelül 7-szer tisztítottunk. Ily módon 1 óra múlva 30 C°-on 1,7 g D-karbamoil-származék képződik, ami a teljes hidrolízis mintegy 80%-ának felel meg. 6. példa A 2. példában megadott körülmények között, 30 perc után 30 C°-on, a Pseudomonas sp. 945 CBS 146.75 törzzsel 352 mg 5-(D,L)-fenil-hidantoinból 220 mg N-karbamoil-fenil-glicint kapunk, ami az elméleti kitermelés mintegy 57%-ának felel meg. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás 5-(D,L)-fenil-hidantoin D-(-)-N-karbamoil-fenil-glicinné történő hidrolizálására, azzal jellemezve, hogy a hidrolízist különböző Pseudomonas speciesek -3
