172153. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitisz virus eltávolítására
5 172153 6 A gélszármazék előállítása A SepharoseR aktiválását úgy végeztük el, hogy vízzel gondosan kimostunk 100 ml megfelelően leülepedett SepharoseR 4B-t (gyártó cég Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország). (A SepharoseR nagymolekulasúlyü, agaróz tartalomra standardizált heterogén poliszacharid-keverék.) A folyadék feleslegét ezután leszívattuk, majd a gélt 4 g brómcián 100 ml desztillált vízzel készített oldatához adtuk. Hagytuk, hogy keverés és jeges hűtés közben 15 perc alatt egyensúly alakuljon ki, majd a gélszuszpenziót 6—7 percig aktiváltuk 11,0 pH-értéken. A pH-t állandó értéken tartottuk 4 M nátriumhidroxid-oldat hozzáadásával. Az etiléndiaminnal történő reagáltatáshoz az aktivált gélt üvegszűrőn hideg 0,5 M, 9,8 pH-értékű nátriumhidrogénkarbonát-nátriumkarbonát oldattal mostuk, majd hozzáadtuk 10 g etiléndiamin 100 ml desztillált vízzel készített oldatához, amelynek a pH-ját 9,8-re állítottuk be tömény sósavval. A reakcióelegyet 20 órán át kevertük szobahőmérsékleten, s a kapott gélt alaposan kimostuk. A kapott, elválasztót tartalmazó gél vizes szuszpenziójának 25 ml mennyiségét 20 ml dioxánban szuszpendáltuk. 6 g oktil-borostyánkősavanhidrid 60 ml dioxánnal frissen készített oldatát cseppenként hozzáadtuk keverés közben szobahőmérsékleten. Híg nátriumhidroxid-oldat segítségével a pH értékét 7,5—8 között tartottuk. Az adszorbenst alaposan kimostuk dioxánnal, dioxán és víz 2: 1 arányú elegyével, vízzel, 1 M nátriumklorid-oldattal és egy 7,5 pH-értékű pufferoldattal, amely 0,05 M triszből [trisz(hidroximetil)-aminometán], 0,02 M nátriumcitrátból és 0,10 M nátriumkloridból állt. A továbbiakban „puffer” elnevezéssel erre a puífer-oldatra hivatkozunk, ha másképpen nem jelöljük. Az összekapcsolási reakció oktil-borostyánkősavra számított hozamát protonmágneses rezonancia spektroszkópiával (HA 100) határoztuk meg; az értéke 4,8% volt. Azonos eredményt kapunk, ha az etiléndiamin helyett 1,4-diaminobutánt vagy 1,6-diaminohexánt használunk. Au-antigén vizsgálat Kiindulási anyagként Au-antigénre pozitív plazmát használtunk, amelynek a titere 1: 64 volt immunelektro-ozmoforézis teszt alapján, és 1 ; 32 az immundiffúziós teszten. A titer értéket egy standard antigénhez viszonyítva adjuk meg. 6 kémcső mindegyikéhez 2 ml, Au-antigénre pozitív plazmát és 2 ml szuszpenziót adtunk, amely 3 rész, a pufferrel egyensúlyba hozott, jól leülepített adszorbensből és 1 rész pufferből állt. A mintákat 1, 2, 5,10, 20 illetve 30 percig mozgattuk, és a géleket centrifugálással elkülönítettük. A folyadék tisztáját megvizsgáltuk Auantigénre, és negatív eredményt kaptunk immunelektro-ozmoforézis, immundiffúzió és Hepanosticon tesztek alapján. 2. példa Au-antigén eltávolítása plazmából SepharoseR-(hexametiléndiamin-dodecil-borostyánkősav)-konjugátummal történő adszorpcióval A gélszármazék előállítása A SepharoseR térhálósításához 100 ml gélt 2 ml epiklórhidrinnel és 0,5 g nátriumborhidriddel elegyítettünk, és az elegyet 1 órán át erőteljesen kevertük 60 °C-on. A gélt meleg vízzel alaposan kimostuk, és 0,25 g nátriumborhidrid 50 ml 2 M nátriumhidroxiddal készített oldatával elegyítettük. Az elegyet 1 órán át tartottuk autoklávban 120 °C-on, majd a gélt lúgos nátriumborhidrid-oldattal mostuk, annyi tömény ecetsavat adtunk lassan hozzá, hogy az elegy pH-értéke 4 körül legyen. Végül a gélt nagy mennyiségű vízzel mostuk. A SepharoseR-hexametiléndiamin, elválasztót tartalmazó gélt az 1. példában ismertetett módon állítottuk elő. A kapott, elválasztót tartalmazó gélből 25 ml menynyiséget üvegszűrőn dioxán és éter 2: 1 arányú elegyével mostunk, majd leszívatva megszárítottuk, és hozzáadtuk egy frissen készített oldathoz, amely 1 g dodecil-borostyánkősavat, 1,5 g vízoldható karbodiimidet-N-ciklohexil-N'-[beta-(N-metil-morfolino-etil)]-karbodiimid-p-toluol-szulfonát—és 60 ml 2: 1 arányú dioxán— víz elegyet tartalmazott. A reakcióelegyet 1 órán át kevertük szobahőmérsékleten, majd üvegszűrőn alaposan kimostuk a gélt dioxánnal, dioxán és víz 2: 1 arányú elegyével, 1 M nátriumklorid-oldattal, vízzel és pufferrel. Az összekapcsolási reakciónak az alkalmazott zsírsavra számított hozamát protonmágneses rezonancia spektroszkópiával (HA 100) határoztuk meg; az értéke 2,0% volt. Au-antigén vizsgálat Kiindulási anyagként olyan Au-antigénre pozitív plazmát használtunk, amelynek a titere immundiffúzió és immunelektro-ozmoforézis alapján 1: 128 volt. Egy 1,6 cm átmérőjű és 1,0 cm magasságú oszlopot megtöltöttünk a pufferrel egyensúlyba hozott gélszármazékkal. 7 ml, Au-antigénre pozitív plazmát szivattyúztunk a gélre, 5 ml/óra sebességgel. Addig adtunk ezután az oszlopra puffert, amíg további fehérje anyagot már nem oldott ki. Ezt ultraibolya spektroszkópiával ellenőriztük. A felfogott eluátum negatívnak bizonyult az immundiffúzió, az immunelektro-ozmoforézis és a Hepanosticon tesztek alapján. Nyomást alkalmazó dialízis segítségével az eluátumot 10-szeresre koncentráltuk, és a fenti hepatitisz tesztek még ekkor is negatív eredményt adtak. 3. példa Au-antigén eltávolítása plazmából SepharoseR-kaprilhidrazid-konjugátummal történő adszorpcióval A gélszármazék előállítása Kaprilsav-etilésztert ismert módon hidraziddá alakítottunk. 10 ml kaprilsav-etilésztert 10 ml 98%-os hidrazin-hidráttal elegyítettünk, majd oldószerként annyi etanolt adtunk hozzá, hogy a reakcióelegy kitisztuljon. (Ehhez 22 ml etanolra volt szükség). Ezután az oldatot 15 órán át állni hagytuk szobahőmérsékleten. A kris-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
