171838. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(alfa-fenil-alfa-amino)- acetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav észterek előállítására
11 171838 III. táblázat 12 7-ADCA-észter Mycoplana Protaminobacter Pseudomonas Pseudomonas (csak az észterező dimorpha alboflavus melagenum maltophilia csoportot adjuk meg) (IFO— 13 213) (IFO— 132 21) (IFO— 12 020) (IFO-12 690) A! B3 A' | B3 A' B" A' B3 benzil+ <5% ± <5% ± <5% ± <5% bisz-(p-metoxi-fenü)-metil± <5% ± <5% ± <5% + <5% 2,2,2-triklór-etil+ 12% + 8% + 10% + 6% benzhidril+ <5% ± <5% ± <5% + <5% 3,5-dimetoxi-benzil+ <5% + <5% + <5% ± <5% 3,5-di-terc-butil-4-hidroxi-benzil± <5% + <5% ± <5% ± <5% terc-butil+ 8% ± 5% + 6% + <5% trifenil-metil+ <5% + <5% ± <5% ± <5% H(7—ADCA)1 + + + 65% + + + 68% + + + 70% + + 45% i A 7—ADCA-ra vonatkozó adatok egy órás reakcióidő, míg a 7—ADCA-észterekre vonatkozó adatok négy órás reakcióidő után mértek. 2 A = a termék hozama. 3 B = A 7—ADCA-észter mennyiségének százalékos csökkenése. 1. példa Az alábbi IV. táblázatban felsorolt mikroorganizmusok 1 napos ferde tenyészetéből egy oltókacsnyi meny- 25 nyiségű anyaggal beoltunk 200 ml-es lombikba töltött, 20—20 ml-nyi A jelzésű táptalajt, majd a tenyészeteket rázás közben 20 órán át 28 °C-on inkubáljuk. A kapott tenyészetek mindegyikéből ezután a sejteket centrifugálás útján elkülönítjük, majd az elkülönített sejteket 30 20 ml 0,05 mólos foszfát-pufferoldattal (amelynek pH-ját előzetesen 6-ra beállítottuk) mossuk, és ugyanebből a pufferoldatból 10—10 ml-ben szuszpendáljuk. Az így kapott sejtszuszpenziókat 2,5—2,5 ml mennyiségben kémcsövekbe töltjük. Ekkor 2,5—2,5 ml, a fentiekben 35 említett foszfát-pufferoldattal elkészítjük a D-2-fenil-glicin-metilészter 30 millimólos, illetve az alábbi táblázatban felsorolt 7—ADCA-észterek 60 millimólos oldatát, majd az így kapott oldatokat a kémcsövekbe töltött sejtszuszpenziókhoz adjuk. A kémcsöveket ezután ráza- 40 tás közben 37 °C-on tartjuk, és minden egyes reakcióelegyből az inkubálás megkezdése utáni 0, 30., 60. és 120. percben 0,5—0,5 ml-es mintákat veszünk. Minden egyes mintához 2,0 ml tetrahidrofuránt adunk, majd a sejteket és a denaturált fehérjét centrifugálás útján elkü- 45 lönítjük. A kapott felülúszó folyadékfázisban mérjük a reagálatlan 7—ADCA-észter, valamint a képződött termék mennyiségét, továbbá a cefem-mag százalékos kihozatalát és más változókat. Az így kapott adatokat összehasonlítjuk a 0. percben vett minta megfelelő adataival, hogy megállapítsuk a reakció következtében végbement változásokat. A 7-ADCA-észter mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy a fenti módon kapott felülúszó folyadékfázisból 0,5 ml-es mintát veszünk, majd az így vett mintát bepároljuk, a bepárlási maradékot hangyasav 5%-os vizes oldatával 5,0 ml térfogatra feltöltjük, és az észter koncentrációját az 1. referenciapéldában ismertetett módon Marelli módszerével megállapítjuk. A termékként képződő 7-(a-fenil-a-amino)-acetamido-3-metil-cefem-4-karbonsav-észtereket szilikagélen végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat útján — futtatószerként vagy n-butanol, ecetsav és víz 4: 1: 5 elegyének felső fázisát, vagy kloroform és aceton 8: 2 arányú elegyét használva — ibolyántúli fényt abszorbeáló, ninhidrinre pozitív foltokként határozzuk meg. A cefem-mag százalékos kihozatalát a felülúszó fázis 260 m(j.-nál mérhető fényabszorbciójából határozzuk meg. A kísérletekben használt 7—ADCA-észterek nevét és a 60 perces reakcióidő után kapott eredményeket az alábbi IV. táblázatban adjuk meg. Kontrollként 7— ADCA-t reagáltattunk azonos körülmények között. A 7—ADCA metil-szulfonil-etilészteréből és etil-szulfonil-etilészteréből előállított termékeket azonosnak találtuk a kémiai úton előállított cephalexin-metil-szulfonil-etilészter és cephalexin-etil-szulfonil-etilészter mintáival. [Cephalexin: 7-(oc-fenil-a-amino-acetamido)-3--metil-cef-3-em-4-karbonsav.] IV. táblázat Xanthomonas oryzae (IFO—3995) Xanthomonas citri (IFO—3835) 7—ADCA-észter (csak az észterező csoportot adjuk meg) Termék mennyisége A 7—ADCA-észter mennyiségének csökkenése A cefem-mag kihozatala Termék mennyisége A 7—ADCA-észter mennyiségének csökkenése A cefem-mag kihozatala metil-szulfonil-etiletil-szulfonil-etil-H(7—ADCA) +++ +++ +++ 80% 85% 72% >95% >95% >95% ++ + +++ +++ 85% 81% 82% >95% >95% >95% A metil-szulfonil-etilészter termék, vagyis a 7-(a-fenil-a-amino-acetamido)-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav-metil-szulfonil-etilészter infravörös spektruma (kálium-bromid pasztillában) 1775, 1732 és 1688 cm-1 ; NMR-spektruma (D 2 0-ban felvéve): 2,15 (3H), 3,11 (3H), 3,34 (2H), 3,7 (2H), 5,08 (1H), 5,60 (1H), 5,68 (1H) és 7,55 (5H) p.p.m. (A spektru-6
