171719. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikum előállítáásra
15 171719 16 ban vettük fel, amikor is belső etalonként ugyanazzal az oldószerrel készített tetrametilszilán-öldatot alkalmaz» tunk. Mérőműszer: XL típusú spektrométer (gyártja: Varian Associates, Kalifornia); 25,2 MHz, protonzaj» csatolásmentesítés. 3. ábra A 3. ábra az antibiotikum infravörös színképét mutatja. KBr-pirulákban az alábbi hullámhosszaknál vannak abszorpciós sávok: Frekvencia (cm"1 ) Intenzitás Frekvencia Intenzitás 3440 s 1290 W 2960 m 1200 m 2920 m 1060 s 3440 s 1290 w 2960 m 1200 m 2920 m 1060 s 2850 m 1020 s 1630 m 985 m 1570 s 940 m 1445 m 905 m 1405 m 780 m 1375 m 750 m 1310 w Az intenzitásokat s, m és w jellel jelöljük. Az s-intenzitású sáv intenzitása a spektrum legerősebb sávja intenzitásának legalább 2/3-a. Az m-intenzitású sáv intenzitása a legerősebb sáv intenzitásának 1/3-a—2/3-a, míg a w-intenzitású sáv intenzitása a legerősebb intenzitás 1/3-át sem éri el. A fenti becslések a százalékos átbocsátás alapján készültek. 4. ábra A 4. ábra a 220 MHz-nél felvett 'H magrezonanciaspektrumot mutatja. Az oldószer és a belső etanol az 1. ábránál megadottal egyezik. Mérőműszer: HR—SC-spektrométer (gyártja: Varian Associates, Kalifornia). A találmány szerinti antibiotikum előállítását az alábbi példákkal világítjuk meg. A közelebbről nem definiált százalékos adatok súlyszázalékokra vonatkoznak. 1. példa Ferde agar táptalaj összetéte le: Pepton 0,25% Kazein-hidrolizátum, savas 0,25% K2 HP0 4 • 3H2 0, p.a. 0,10% KCl, p.a. 0,05% MgS04 , p.a. 0,05% FeS04 , p.a. 0,01% nádcukor 3,00% agar 2,00% viz ad 100,00% „A" tápoldat összetétele: szójaliszt, zsírmentesített 3,0% glicerin, tiszta 3,0% CaC03 , p.a. 0,2% víz ad 100,0% 10 15 20 25 30 35 40 45 Erlenmeyer-lombikokban 140—140 ml steril „A" tápoldatot a fenti összetételű ferde agáron nőtt Actinoplanes CBS 434.74 Mikroorganizmus fnicéliumával beoltunk. A lombikokat 28 °C-on körrázógépen 8 napon át inkübáljuk, utána mintákat veszünk és centrifugáljuk. Megvizsgáljuk a tiszta, felül úszó oldatnak äz agarlemez-lyuktesztben Escherichia coli ATCC 9637 elleni hatását. A tenyészoldatban levő antibiotikum mintegy 17 mm átmérőjű gátolt növekedésű zónákat eredményez. Az antibiotikum elkülönítését a 3. példában írjuk le. 2. példa Tápoldat összetétele: dextrin 0,4% glicerin 0,2% élesztőkivonat 0,2% CaC03 0,2% csapvíz ad 100,0% Habmentesítés céljából hidroxilcsoportokat tartalmazó semleges poliolt (Niax Polyol LHT 67; gyártja: Union Carbide Belg. N. V.) adunk a tápoldathoz 3,0 ml/8 liter mennyiségben. Levegőztető berendezéssel és keverővel ellátott üvegfermentorokba 8—8 litert töltünk a fenti tápoldatból, a pH értéket nátriumhidroxid-oldattal 6,8»ra állítjuk be, és az oldatot 120 °C-on sterilizáljuk. A lehűlt oldatot az SE—73/B törzs 3 napon át „A" tápoldatban tenyésztett kultúrájának 240 ml-ével (3,0 tf.%) beoltjuk és mintegy 4 liter levegőt vezetünk át percenként, a keverő fordulatszámát kb. 600-ra állítjuk be, és a hőmérsékletet 28 °C-on tartjuk. A tenyésztés kezdete után 17, illetve 24 órával 0,4% dextrint, 0,2% glicerint és 0,3% élesztőkivonatot adagolunk a fermentorokba. 30, 41, 48 és 54 óra elteltével 0,4% dextrint, 0,2% glicerint és 0,4% élesztőkivonatot adagolunk. A fenti adalékokat tömény oldat alakjában adjuk a tenyészethez (200 ml/adalék). A tenyészet térfogata nem változik, mert a víz elpárolgása ellensúlyozza a hozzáadott térfogatokat. A tápoldatkomponensek összkoncentrációja az adalékokkal együtt: dextrin 2,8%; glicerin 1,4%; élesztőkivonat 2,4% és CaC03 0,2%. 120 óra elteltével a tenyésztést befejezzük. 3. példa Habmentesítés céljából hidroxicsoportokat tartalmazó semleges poliolt (Niax Polyol LHT 67; gyártja: Union Carbide Belg.) adunk a tápoldathoz 1 csepp/140 ml mennyiségben. 5 db üvegfermentornak a 2. ábra szerint kapott tenyészfolyadékát (5X8 liter) egyesítjük, hozzáadunk 50 48 liter acetont, az elegyet 25 °C-on egy órán át keverjük, majd centrifugáljuk. A tiszta, micéliummentes folyadékot 20—35 °C-on vákuumban mintegy 35 liter térfogatra betöményítjük, nátriumhidroxid-oldattal pH 9-re beállítjuk és 18 liter etilacetáttal extraháljuk. 55 A szerves fázist kiontjuk, a vizes fázist konyhasóval telítjük, utána pH értékét nátriumhidroxid-oldattal 8,5-re állítjuk be, és 9—9 liter etilacetáttal kétszer extraháljuk. A szerves fázist kiontjuk. A szerves fázist vákuumban mintegy 1 liter térfogatra bepároljuk, majd a 60 nyers antibiotikumot 3 liter n-hexán hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot leszívatjuk, kevés éterrel mossuk, majd keverés közben vízhez adagoljuk, amikor is a pH értéket 10%-os nátriumkarbonát-oldattal 7,3 értéken tartjuk. Az oldatot liofllizálva 10,5 g nyers (kevés nát-65 riumkarbonátot tartalmazó) antibiotikumot kapunk.
