171576. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gamma-L-glutamil-taurin izolálására

171576 8 1. példa Gamma-L-glutamil-taurin kinyerése természetes eredetű anyagból. 5 10 g liofilizált és őrölt mellékpajzsmirigy port az alábbi ismert módon zsírtalanítunk (Auerbach szerint). A mirigyport szobahőmérsékleten 25 ml abszolút acetonnal alaposan elkeverjük, majd a szuszpenziót üvegszűrőn szűrjük. (G4 Schott.) A jól io leszívatott mirigyport ezután ismételten szobahőmérsékleten alaposan felkeverjük kloroformmal és a szuszpenziót ismét üvegszűrőn szűrjük. Ezt a műveletet megismételjük. A leszűrt anyagot ismételten felszuszpendáljuk 25 ml abszolút acetonnal 15 és üvegszűrőn alaposan leszívatjuk. A kapott mirigyport szobahőmérsékleten vákuumban megszárítjuk. A -kapott zsírtalan, száraz mirigypor súlya 7-9 g, a kezdeti anyag zsírtartalmától függően. 10 g zsírtalanított és szárított mirigyport 20 3x100 ml desztillált vízzel 30C°-on extraháljuk, műveletenként 1—1 óráig. Az extrakciós műveletek között a mirigyport a vizes oldatról szeparáljuk gyorsfordulatszámú laboratóriumi centrifugával. Az extrahált frakciókat nitrogénatmoszféra alatt 25 3-5 C°-on jégszekrényben tároljuk további felhasználásig. A vizes extraktum reakciója ninhydrinnel biurettel és triklórecetsawal pozitív. A következő műveletben a vizes extraktumokat összeöntjük, ezután 50%-os triklórecetsav vizes ol- 30 datot csepegtetünk a vizes extrakthoz, állandó rágozatás közben úgy, hogy a végső triklórecetsav koncentráció 15%-os legyen. A csapadékos vizes oldatot jégszekrényben 3-5 C° között 2 óra hosszáig állni hagyjuk és 35 utána a triklórecetsav hatására képződött csapadékot centrifugáljuk. A szűrt oldat triklórecetsav hozzáadásra már nem képez csapadékot. A triklórecetsav feleslegét szobahőmérsékleten végzett sorozatos extrakcióval távolítjuk el. Az 40 extrakcióhoz vizes étert használunk, a triklórecetsav teljes eltávolításához általában 17-18 éteres extrakció szükséges. Előfordulhat azonban, hogy 20-25 extrakció szükséges. Az utolsó extrakció után a vizes fázis kémhatásának pH = 4,5-5 között 45 kell lennie. A vizes fázis étertartalmát nitrogénatmoszférában 30C°-ot nem meghaladó hőmérsékleten vízsugárszivattyúval létesített vákuumban távolítjuk el. 50 A művelet kb. 6 órát vesz igénybe. Az étereltávolítás művelete térfogatcsökkenéssel jár, tekintettel arra, hogy a vákuumbepárlás során a víz egy része is elpárolog. Az éter-eltávolításáról szaglással győződünk meg. 55 A vizes oldatot ezután liofilizáljuk és jól záró edényben tartjuk, mivel az anyag-hígroszkópos. A kitermelés a zsírmentesítés előtti mirigypor súlyára számítottan 10—15%-os, a kiindulási anyag zsír- 60 tartalmától függően. A kapott liofilizált anyagot ezek után gélfiltráljuk, Sephadex G-15-tel (Pharmacia Sweden Uppsala, részecskenagyság 90-120 mikron) leszálló technológiával. 65 Az elúciós diagrammot 280nm-en mért extinkcióval határozzuk meg. Ezzel a módszerrel összesen 7 csúcsot kapunk (A—G-ig). A gélfiitráció karakterisztikus paraméterei az alábbiak: Bemérés: 5,1 g liofilizált anyag 10 ml desztillált vízben oldva Oszlopátmérő: 4,85 cm Oszlopmagasság: 149 cm Átfolyási sebesség: 0,78 ml/perc Frakcióméret: 7,8 ml Frakcióméret: 7,8 ml/cső Csúcs: Csőszám: A 77-103 B 104-128 C 129-134 D 135-162 E 163-189 F 190-217 G 218-227 Az aktív anyagot a B jelzésű csúcs tartalmazza. A 104-es csőig az elúció térfogata 814 ml, a B csúcs teljes térfogata 188 ml. A B frakciót ezután liofilizáljuk. Ennek súlya 0,43-0,53 g, 5g körüli kiindulási anyag esetén. A gélfiitráció azonosítása: A megadott körülmények mellett gélfiltrálva, a hatóanyag az eluátumban a (0,67±0,02)x V térfogatnál jelenik meg. V azt az elúciós térfogatot jelenti, ahol az anorganikus ionok megjelennek az eluátumban. (Pozitív klorid-reakció ezüstnitráttal kémlelve). A liofilizált B csúcsot ezután ioncserés oszlopkromatográfiának vetjük alá. 301 mg a B csúcsból származó liofilizált anyagot annyi l,8pH-jú hangyasavecetsav elegyben oldunk, hogy az oldat 30%-os legyen, majd az oldatot Dowex 50x2-t (Dow Chemicals USA) tartalmazó 132x1 cm méretű oszlopon kromatografáljuk, miután az oszlopot hangyasav-ecetsav eleggyel l,8pH-ra aequüibráltuk. Átfolyási sebesség 13 ml/óra. Frakcióméret: 4 ml. A frakciókat 280nm-nél extinkciós érték alapján határozzuk meg. Dy módon, összesen 9 elúciós csúcsot nyerünk (A—l-ig). 4