171576. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gamma-L-glutamil-taurin izolálására
9 171576 10 Jel: Csőszám: Súly (mg): A 9-12 8,4 B 13-17 18,4 C 18-23 64,4 D 24-29 5,2 E 30-36 2,2 F 37-42 0,5 G 43-50 3,1 H 51-57 7,3 I 58-80 6,8 116,3 (38,6%) Az aktív anyagot a D, E, F csúcsokban találjuk meg. E három csúcs összeöntött eluátumát liofíli- 25 zálva 7,9 mg anyagot nyerünk, mely a kiindulási gélfiltrált B csúcsnak 2,62%-a. A liofilizált ioncserés oszlopkromatográfiával nyert csúcsokat ezután 22 cm széles Whatman 3 MM papíron elektroforetizáljuk l,8pH-n, 1500 V 30 feszültség mellett 90 percig. Az aktív hatóanyag reakciója ninhidrinnel pozitív és a kiindulási alapvonalról egységesen a pozitív sarok felé vándorol, Ciszteinsavra vonatkoztatott relatív mozgékonysága pHl,8 értéknél 0,53. 35 Elektroforézis után a ninhydrin-pozitív megfelelő vándorlási sebességű csíkot úgy kell kivágni és átvarrni az új papírkromatográfiás ívre, hogy a kromatográfiás futtatás iránya ellentétes legyen az elektroforetikus vándorlási iránnyal. A leszálló pa- 40 pírkromatográfiás továbbtisztítási módszert n-butanol: piridin : jégecet : víz = 15 :10 :3 :12 elegyében végezzük szobahőmérsékleten, 60 óra alatt. A használt papír: Whatman 3 MM. A vegytiszta vegyület Rf értéke az adott futtató 45 rendszerben = 0,19. Ciszteinsavra számított relatív mozgékonysága pH = 6,5-ös papírelektroforézisnél 0,74. Sósavas hidrolízis után a termék glutaminsavat és taurint tartalmaz. Az izolált anyag karboxipeptidáze-val nem hidrolizálható. 50 M = 254,27 Analízis C7 H 14 N 2 0 6 S 2. példa Litoralon tisztítása elektroforetikusan egységes termék előállítására 60 1,5 g mintegy 92%-os tisztaságú Litoralont 5 ml 0,1 n ecetsavban oldunk és az oldatot felvisszük egy 2,3x15 cm-es anion-cserélő -előnyösen Amberlite IRA400 jelű anion-cserélővel töltött — oszlopra, amelyet előzetesen acetát-ciklusba hoz- 65 tunk. Először 0,1 n ecetsavval eluálunk és 10 db 54 ml-es frakciót szedünk (ezekben a neutrális és gyengén savas szennyezések találhatók). A Litoralon eluálására 0,1 n sósavval további 12 db 54 ml-es frakciót szedünk. (Az ecetsavas frakciókat is beleszámítva összesen 22 frakciónk lesz.) A Litoralon várhatóan a (16), 17., 18., 19., 20. és (21). frakciókban jelenik meg. Ezeket a frakciókat -külön-külön- 25C°-ot meg nem haladó fürdőhőmérsékleten, 2-4Hgmm-es vákuumban bepároljuk, majd a tömény oldatot liofilezzük. A többi frakciót döntjük. A liofilezett termékeket grammonként 15 ml analitikai tisztaságú acetonnal felvesszük és szobahőmérsékleten néhány óráig kristályosodni hagyjuk. A kristályokat nuccs-szűrőn szűrjük, acetonnal bőven fedjük, majd levegőn, szobahőmérsékleten szárítjuk. Az ecetonból nyert kristályokat — frakciónként - grammonként 3 ml desztillált vízzel felvesszük, kevés csontszénnel mintegy 1 órán át állni hagyjuk, majd a szenes oldatot szűrjük, a szenet az acetonból nyert kristályok grammjára számolva 1 ml vízzel mossuk. A kapott vizes oldatokat (szűrlet + mosó folyadék) négyszeres térfogat abszolút etanollal összekeverve a Litoralont kicsapjuk. A keveréket egy éjjelen át jégszekrényben kristályosodni hagyjuk, majd nuccs-szűrőn szűrjük és a kristályokat abszolút etanollal bőven fedjük. Tájékoztató egységesség-vizsgálat után a 16—18. frakciókból származó Litoralon-kristályokat homogenizáljuk, majd az előzővel azonos módon vizes etanolból ismételten átkristályosítjuk. Az így nyert kristályokat levegőn, majd foszfor-pentoxid felett, szobahőmérsékleten súlyállandóságig szárítjuk. 0,84 g Litoralont nyerünk. Bomláspont: 233 C°, [a]p° = + 17°, hatóanyag-tartalom (acidimetriásan) = 100%. A termék vékonyréteg-kromatográfiásán és elektroforetikusan egységes. A 19-20. frakciókból további 0,35 g Litoralont nyerünk, amelynek analitikai adatai a fentieknek megfelelnek, azonban elektroforetikusan halvány neutrális szennyező foltot tartalmaznak. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás gamma-L-glutamil-taurin mellékpajzsmirigy-kivonatból való izolálására, azzal jellemezve, hogy a mellékpajzsmirigy, vagy annak szövet- vagy sejt-tenyészetének előnyösen por alakjában vízzel, vagy szervetlen ionokat tartalmazó vizes oldattal való extrahálása, a szűrt extrakt fehérjementesítése és liofilizálása után az anyagot vízben feloldjuk, az oldatot gélfiltráljuk, előnyösen spektroszkópiai detektálással a hatóanyagot tartalmazó frakciót kiválasztjuk, liofilizáljuk, majd vízben oldjuk és a kapott hatóanyag-koncentrátumot elektroforézisnek vetjük alá, végül kromatográfiás módszerrel a gamma-L-glutamil-taurint elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, h«gy a gélfiitrációnál azt a frakciót választjuk ki, amely az eluálás során a V0 5
