171400. lajstromszámú szabadalom • Eljárás csökkent amiláz-inhibitor tartalmú szacharáz-inhibitor előállítására

5 171400 6 AE) azt az enzim-mennyiséget értjük, amely az alább megadott kísérleti körülmények között, egy perc alatt 1 mikron-ekvivalens glükozid-kötést képes a keményítőben hasítani. Az így hasított kötések /xVal-ban kifejezett mennyiségét a képződött juVal redukáló- 5 -cukor alakjában határozzuk meg kolorimetriásan, dinitro-szalicilsav segítségével, ezt azután egy maltóz-kalibrálási görbe segítségével /zVal maltóz-ekvivalens egységekben adjuk meg. 10 E meghatározás lefolytatása céljából 0,1 ml amiláz-oldatot (20—22 AE/ml amiláz-aktivitással) alkalmazunk és ehhez 0— 10 /ug inhibitort vagy 0-20^1 vizsgálandó oldatot adunk 0,4 ml 6,9 pH-értékű pufferoldatban, amely 0,02 m nátrium-glicero- 15 foszfát/0,001 m CaCl koncentrációjú. Ezt az elegyet azután körülbelül 10-20 percig 35 C° hőmérsékletű vízfürdőben tartjuk egyensúlybahozatal céljából. Ezután 0,5 ml 35 C° hőmérsékletre melegített 1%-os keményítőoldatot (Merck-féle oldható keményítő, 20 1252 sz.) adunk hozzá és 5 percig inkubáltatjuk 35 C° hőmérsékleten, ezt követően pedig 1 ml dinitro-szalicilsav-reagenst (P. Bernfeld szerint, Colowick-Kaplan, Meth. Enzymol., 1. kötet, 149. lap) adunk hozzá. A szín előhívása céljából az elegyet 25 forrásban levő vízfürdőn tartjuk 5 percig, majd lehűtjük és 10 ml desztillált vizet adunk hozzá. Az extinkciót 540 nm-nél mérjük, ugyanígy összeállított, de amilázt nem tartalmazó vakpróbával összehasonlítva. Értékelés céljából azután egy előzetesen 30 felvett amiláz-kalibrálási görbe segítségével megállapítjuk az inhibitor hozzáadása után még megmaradt amiláz-aktivitást és ezekből az értékekből kiszámítjuk a beadagolt amiláz gátlásának százalékarányát. A százalékos gátlást a 35 /ig inhibitor AE 40 hányados függvényeként visszük fel a görbére (e hányadosban a számláló a szárazanyagra számított inhibitor-mennyiséget, a nevező pedig az inhibitor nélküli vakpróbában mért amiláz-aktivitást fejezi ki) és a görbéből leolvassuk az 50%-os gátlási pontot, 45 amelyet azután AIE/mg egységekben kifejezett inhibitor-mennyiségre számítunk át. A szacharáz-inhibitor-aktivitás vizsgálata 50 Szacharáz-inhibitor-egység (SIE) alatt azt az inhibitor-mennyiséget értjük, amely 2 szacharáz-egységet 50%-ban gátol. A szacharáz-egység (SE) az az enzim-mennyiség, amely az alább megadott kísérleti 55 körülmények között 1 /umól szacharózt 1 perc alatt bont glükózra és fruktózra. A kapott glükóz jumól-ban kifejezett mennyiségét a glükóz-oxidáz-reakció segítségével határozzuk meg mennyiségileg, oly körülmények között, amelyeknél a szacharáz 60 általi további szacharáz-hasítás már nem következik be. A vizsgálat lefolytatása céljából 0,05 ml 0,12 SE koncentrációra beállított szacharáz-oldathoz 0-20 jug inhibitort vagy 0-20 pl vizsgálandó oldatot adunk és 6,0 pH-értékű 0,1 mólos nátrium-maleinát puffer- 65 oldattal 0,1 ml térfogatra töltjük fel. Az e célra alkalmazott szolubilizált szacharázt a sertés-vékonybél nyálkahártyájából nyerjük, B. Borgström és A. Dahlquist, Acta. Chem. Stand. 12, 1997, 1958, szerint és 0,1 mólos, 6 pH-értékű nátrium-maleinát pufferoldattal a megfelelő SE-tartalomra hígítjuk. A fenti módon kapott elegyet 35 C° hőmérsékleten 20 percig inkubáljuk, majd 1 ml glükóz-oxidáz-reagens hozzáadása útján a szacharáz-reakciót megszakítjuk és az elegyet további 30 percig inkubáljuk 35 C° hőmérsékleten. Az erre a célra alkalmazott glükóz-oxidáz-reagenst oly módon állítjuk elő, hogy 2 mg glükóz-oxidázt (a Boehringer cég 15 423 EGAB jelű készítménye) 100 ml 0,565 mólos trisz-HCL-puffer-oldatban (pH = 7) oldunk, majd 1 ml detergens-oldatot (2 g „Triton 100" + 8 g 95%-os p.a. minőségű etanol), lml dianizidin-oldatot (260 mg o-dianizidin • 2 HCl 20 ml vízben ) és 0,5 ml 0,1%-os vizes peroxidáz-oldatot (a Boehringer cég „15 302 EPAP"jelű készítménye) adunk az oldathoz. Az elegyhez azután 1 ml 50%-os kénsavat adunk és 545 nm-nél meghatározzuk az extinkciót, egy azonos módon elkészített vakpróbához viszonyítva. A kiértékelés céljából kiszámítjuk a beadagolt szacharóz százalékos gátlását és az 50%-os gátlási pontból - egy glükóz-kalibrálási görbe segítségével — a kapott értéket SIE/g illetőleg SIE/liter értékre számítjuk át. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 1. példa Egy egyliteres Erlenmeyer-lombikban 120 ml tápközeget, amely 3,5% glükózt, 0,5% kazein-hidrolizátumot, 1,3% élesztőkivonatot, 0,3% kalcium-karbonátot és 0,3% dikálium-hidrogén-foszfátot tartalmaz, sterilizálás előtt 7,8 pH-értékre állítunk be, kálium-hidroxid hozzáadása útján, 121 C°-on 30 percig sterilizáljuk, majd az SE 50 törzs ferde ágáros tenyészetének 120 ml, 3% glicerint, 3% szójalisztet és 0,2% kalcium-karbonátot tartalmazó tápoldatra történő átoltása és a beoltott folyékony tápközeg forgó rázógépben 28 C° hőmérsékleten történő 3 napi inkubálása útján kapott folyékony inokulum-kultúra 4 ml mennyiségével beoltjuk, majd ezt a beoltott kultúrát 24 C° hőmérsékleten fermentáljuk. 3 napi fermentációval 9,1 SIE/ml és 240AIE/ml aktivitást, 4 napi fermentációval pedig 10,4 SIE/ml és 675 AIE/ml aktivitást tartalmazó fermentlevet kapunk. 2. példa Az 1. példában megadott összetételű tápközeghez maltózt adunk az alábbi táblázatban megadott különböző koncentrációkban, majd ezt a maltóz-tartalmú táptalajt oltjuk be és inkubáltatjuk az 1. példában megadott módon. Az így kapott fermentlé 3 napi, illetőleg 5 napi fermentáció után a táblázatban megadott koncentrációjú SIE és AIE aktivitást tartalmaz: 3