171400. lajstromszámú szabadalom • Eljárás csökkent amiláz-inhibitor tartalmú szacharáz-inhibitor előállítására
2714 3 Baarn (Hollandia) intézetnél] lefolytatott többnapos fermentáció útján oly fermentációs leveket kapunk, amelyek 10SIE/ml-t meghaladó mennyiségben tartalmaznak szacharáz-inhibitort. 300—700 AIE/ml amiláz-inhibitor-tartalom esetén így a kapott fer- 5 mentációs lében a SIE : AIE arány 15 • IO-3 - 30 • 10~ 3 • (f = SIE/AIE • ló-3 ). A fentiekben és a leírás további részeiben alkalmazott SIE és AIE rövidítések jelentése: SIE = szacharáz-inhibitor-egység 10 AIE = amiláz-inhibitor-egység. ad 2. A szacharáz-inhibitor termelését még fokozhatjuk, ha a tápközeghez maltózt adunk. Ha például a fent leírt összetételű tápközeghez 1,5% maltózt is adunk, akkor — egyébként azonos 15 körülmények között— például 16—18SIE/ml, sőt kedvező esetben 24 SIE/ml szacharáz-inhibitor-tartalmú fermentlevet kapunk. ad 3. A kapott fermentleben fennálló SIE : AIE arány szempontjából döntő jelentősége van a 20 fermentáció időtartamának. Ha a fermentálást röviddel a maximális SIE-tartalom elérése előtt vagy éppen a maximäis SIE-tartalom elérésekor megszakítjuk — ami a beoltási körülményektől függően már 1,5-2 napi fermentáció után bekövetkezhet - akkor 25 egészen 180-ig menő f-értékeket kapunk. A fentiek értelmében tehát a találmány tárgya olyan új eljárás szacharáz-inhibitornak ezt az inhibitort nagy koncentrációban tartalmazó inhibitor- 30 -készítmény alakjában történő előállítására az SE 50 Actinoplanacea-törzs (letétbe helyezve a Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Hollandia, intézetnél CBS 961.70 nyilvántartási szám alatt) szenes nitrogénforrást, valamint ásványi sókat tartalmazó 35 tápközegben történő tenyésztése útján, amelyet az jellemez, hogy az SE 50-törzset keményítőmentes, előnyösen maltózt tartalmazó tápközegben tenyésztjük, a fermentációt célszerűen közvetlenül az optimális szacharáz-inhibitor tartalom elérése előtt 40 vagy ennek elérésekor megszakítjuk, és a fermentáció során képződött inhibitor-hatású anyagot önmagában ismert módon elkülönítjük a fermentléből. A fent említett SE 50 törzs helyett ugyancsak 45 kedvező eredménnyel alkalmazhatók e törzs mutánsai vagy variánsai is, például a Centraalbureau voor Schimmelcultures intézetnél a CBS 61 471 szám alatt letétbe helyezett SE 50-13 törzs. 50 A kapott fermentléből a szacharáz-inhibitor hatóanyagot vagy oly módon nyerjük ki, hogy a fermentlevet vákuumban eredeti térfogatának 1/10-1/20 részére be tömény ítjük, majd az így kapott koncentrátumot liofilizáljuk, vagy pedig a betörné- 55 nyített oldatból 4—10 térfogatrész szerves oldószer, például alkoholok vagy ketonok, előnyösen 5-9 térfogatrész aceton hozzáadásával kicsapjuk a hatóanyagot, különösen egyszerűen nyerhetjük ki a szacharáz-inhibitor hatóanyagot adszorbeáltatás 60 Útján, amikor is a semlegesre állított fermentléhez 0,5-4%, előnyösen 1-2% aktívszenet adunk, majd az aktívszenet a reá adszorbeálódott hatóanyaggal együtt elkülönítjük, és vizes alkoholokkal vagy acetonnal, célszerűen savas pH-értékeknél, előnyösen 50%-os 65 4 acetonnal, 2-3 pH-értéknél eluáljuk a hatóanyagot az adszorbensről. Az így kapott eluátumot azután vákuumban az eredeti fermentlé térfogatának 1/50-1/200, előnyösen 1/100 részére betöményítjük és valamely szerves oldószer, előnyösen aceton hozzáadásával a hatóanyagot kicsapjuk a betöményített oldatból. Tiszta készítmény előállítása érdekében általában célszerű, ha a kapott fermentléből a szennyező barna színezékeket savas (1-4, előnyösen 2-3) pH-értéknél, 1-2%-aktívszénnel végzett előzetes adszorbeáltatással eltávolítjuk, meglepő módon ilyen pH-értékeknél a hatóanyag még nem adszorbeálódik említésre méltó mértékben az aktívszénen. Ismeretes, hogy az embereknél 'és állatoknál, szacharóz-tartalmú élelmiszerek vagy élvezeti cikkek fogyasztása után hiperglikémia lép fel, a szacharóznak az emésztő traktusban jelenlevő szacharáz-enzimek általi gyors hasítása következtében. (A szacharáz enzim a szacharózt glükózra és fruktózra bontja.) Ilyen hiperglikémia különösen a diabetikus betegeknél lép fel erős mértékben és tartósan. Kövér, zsírszövetekben gazdag alkatú egyéneknél az ilyen alimentáris hiperglikémia gyakran igen erős inzulin-szekrécióval jár, ami viszont a zsír-felépítés fokozását és a zsír-lebontás csökkenését eredményezi. A fent ismertetett eljárással, a találmány szerinti módon kapott és elkülönített szacharáz-inhibitor hatóanyagok jelentősen csökkentik az említett alimentáris hiperglikémiát és hiperinzulinémiát a szacharózzal táplált patkányokon. Ismeretes továbbá, hogy a szacharóztartalmú élelmiszerek és élvezeti cikkek fogyasztása után különösen erősen és gyakran szokott fogszuvasodás (caries) fellépni (vö. például: W. Gold: Advances in Applied Microbiology, 11, 135-157, 1969). A szacharóz-lebontásának a találmány szerint előállított inhibitorokkal történő gátlása csökkenti a kariogén (fogszuvasodást okozó) anyagok képződését. A találmány szerint előállított szacharáz-inhibitor hatóanyag tehát előnyösen alkalmazható gyógyászati célokra az alábbi indikációs területeken: adipositas, hyperlipaemia (atherosklerosis), diabetes, prediabetes, caries. Adagolás: 1000-100 000 AIE/kg testsúly, napi egyszeri vagy többszöri adagban, orálisan, étkezések előtt és/vagy folyamán és/vagy után. A találmány szerint előállított inhibitort tartalmazó gyógyszerkészítmények tabletta, drazsé, kapszula, oldat, szuszpenzió vagy granulátum alakjában, továbbá rágógumiban eloszlatva készíthetők el, vagy pedig adalékként alkalmazhatók a keményítőtartalmú élelmiszerekben és/vagy élvezeti szerekben. A találmány szerint előállított termékekben az inhibitor-aktivitást az alábbi módszerekkel vizsgálhatjuk: Az amiláz-inhibitor-aktivitás meghatározása Az amiláz-inhibitor-egység (1 AIE) az az inhibitor-mennyiség, amely két amiláz-egység mennyiségű enzim hatását 50%-ban gátolja. Amiláz-egységen (1 1
