171392. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kis molekulasúlyú, diaminopimelinsavat tartalmazó vízoldható acetilezett termékek előállítására, Corynebacterium parvum sejtekből
5 171392 6 A találmány szerinti termékek az ember- és az állatgyógyászatban egyaránt használhatók a vírusos vagy a baktériumos eredetű fertőzésekkel szembeni ellenállás növelésére. Ezek az anyagok patogén organizmusok ellen ható antitestek képződését is 5 elősegítik és vakcinák beadásánál kísérőanyagok lehetnek annak érdekében, hogy biztosítsák az antitestek lehető legnagyobb fokú reakcióját. A találmány szerinti eljárás kiterjed olyan gyógyszerészeti készítmények előállítására is, amelyek a 10 találmány szerinti vízoldható termékeket egy vagy több hígítóanyaggal vagy összeférhető segédanyaggal és adott esetben más gyógyszerkészítményekkel, így antibiotikumokkal és vértolulást megszüntető anyagokkal, valamint vakcinákkal együtt tartalmazzák. 15 Ezekben a készítményekben a találmány szerinti vízoldható acetilezett termékek általában 0,1%-nál nagyobb mennyiségben vannak jelen. Ezek a készítmények orálisan, rektálisan, parenterálisan vagy aeroszolok formájában adhatók be. 20 Az embergyógyászatban az adagok a kívánt hatástól függően felnőtteknél 10 mg és 50 mg között változnak naponta. A következő példák a találmány szerinti eljárás bemutatására szolgának, de a találmány oltalmi köre 15 nem korlátozódik kizárólag a példákban leírt .módszerekre. 1. példa 30 20 g zsírtalanított baktériummaradékot, amelyet Corynebacterium parvum ATCC 11 829, sejtekből kiindulva A. Aebi és mtsai. által a Bull. Soc. Chira Biol., 35, 661 (1953) folyóiratban ismertetett módon kapunk, 66 óra hosszat keverünk 28 C°-on 500 ml '> (2:3 arányú) ecetsavanhidrid-piridin-elegyben. Ezután 5000 ml etanolt adunk a reakcióelegyhez és az egészet még 5 óra hosszat keverjük. Ezt követően az oldhatatlan részt centrifugálással (4000 ford/perc) elválasztjuk, A felülúszó részt csökkentett nyomáson H-szárazra pároljuk, a maradékot 100 ml desztillált vízben felvesszük és a vízben oldhatatlan részt centrifugálással (4000 ford/perc) elkülönítjük, majd a felülúszó részt liofilizáljuk Ily módon 3,280 g nyers vízoldható acetilezett terméket kapunk. ~.< 2. példa Az 1, példa szerint előállított nyers vízoldható ' acetilezett terméket Biogel P10 oszlopon (magasság 275 cm. átmérő 2 cm) való szűréssel tisztítjuk, 1.5 ml-es frakciókat szedünk és ezeket 1-től 500-ig terjedő számozással látjuk el. Az eluálást 0,1 n ecetsavval végezzük és a frakciókat 220 m/x-nél és v í 280 nijU-nél spektrofotométeren optikai úton vizsgáljuk A 293-tól 340-ig terjedő frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ily módon 0,195 g vizoldható terméket kapunk, amelyet „DEAE-Biogel A" (Herck) segít- 60 ségével kromatografálunk, ezt 0,01 mólos 7,7 pH-jú piridin-oldattal egyensúlyozzuk. Az eluálást 0,01 mólos piridinnel végezzük és így 0,110g diaminopimelinsavban gazdag anyagot kapunk, ezután fokozatosan 0,01 mólos - 0,2 mólos 65 7,7-5,5 pH-jú piridin-oldószerrel végezve az eluálást 0,080 g vizoldható acetilezett termékhez jutunk, amelynek a jellemzői a következők: - külső megjelenés: sárgás por, - összetétel: a) aminosavak (mólarány): alanin (3), glutaminsav (2), diaminopimelinsav (2), aszparaginsav (1) és glicin (1), b) aminocukrok (mólarány): N-acetilglukózamin (2), N-acetilmuraminsav (2), c) nem-aminált redukció cukrok: mannóz, glukóz és nyomokban galaktóz, — molekulasúly (molekulánként 3 alaninmaradékra számítva): 3750 ± 250, — aminosavtartalom: 22 ± 3%, aminocukortartalom: 26 ± 2%, a maradékot nem-aminált redukáló cukrok és az aminált redukáló cukrokon acetilezéssel rögzített vagy nem rögzített acetilgyökök teszik ki, a diaminopimelinsav mennyisége: 10 ± 1 súly%. Az ily módon kapott vízoldható termék egy acetilezett tetraszacharid-heptapeptid, amely nem-aminált redukáló cukrokhoz kapcsolódik. I A találmány szerint előállított kivonat túlérzékenységre mutatott késleltetett típusú hatását a már említett White-teszttel vizsgáljuk: a) Kísérleti módszer: 350-400 g súlyú Dunklin-Hartley tengerimalacok talpizomzatába egyenként 0,2-0,2, összesen 0,8 ml emulziót adagolunk, melynek összetétele: 500 ßg vizsgálandó adjuváns, 0,4 ml fiziológiás sóoldat (0,85% NaCl), 1 mg baromfi-ovalbumin és 0,4 ml incomplet Freund-adjuváns (víz-ásványi olaj emulzió). 21 nap múlva a kísérleti állatok lágyékát leborotváljuk és intradermálisan 0,1 ml, 100^ig ovalbumint tartalmazó fiziológiás sóoldattal oltjuk be= A bőr pirulását, keményedését és elhalását 24 és 48 óra elteltével meghatározzuk. Kontrollként olyan egyedeket (minden esetben 3 állat) használtunk, melyeket complet Freund-adjuvánssal és ovalbuminnal oltottunk be. (A víz-olaj emulzión kívül H 37 Ra vírussal elölt M. tuberculosis sejteket is tartalmaz.) b) Irodalom: 1. R. G. White, Immunobiol. Standard., 6, 3-11 (1967). 2. R. G. White, Immunobiol. Standard., 6, 49-58 (1967). 3. I. H. Hiu és J. Lo Amiel, Experientia, 28, 953-954(1972). c) Eredmények: Az adjuváns aktivitási hányadosa: A hányadost a csak ovalbumint és ásványi olajat kapott állatokon mutatkozó hatással összehasonlítva határoztuk meg. 3
