171392. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kis molekulasúlyú, diaminopimelinsavat tartalmazó vízoldható acetilezett termékek előállítására, Corynebacterium parvum sejtekből
7 171392 8 .§ Aktivitási hányados c '<§« £ c "> c > ra 'S 13 A készítmény dózisa sg 'C a g .=> ^1 500M g 3af £^ 24 100 /xg ovalbumin 0,82 1,52 48 100/jg ovalbumin 0,19 6,26 II Az adjuváns antitestképződésre mutatott hatásának vizsgálata nyulakban influenzavírussal szemben. a) Módszer: Az alkalmazott antigén tisztított és 0-propiolaktonnal inaktivált humán B/Massachusetts/3/66 influenzavírus« Ezt oly módon hígítjuk, hogy 2000 egység véragglutinátumot (UHA) tartalmazzon ml-enként, hozzáadunk azonos térfogatú ásványi olajat (incomplet Freund-adjuváns) és fele térfogatnyi, pH 7,2 foszfátpufferrel készített adjuváns-oldatot, mely az adjuvánst 2,5 mg/ml koncentrációban tartalmazza. Az így nyert elegy teljes összetétele: B/Mass. antigén, hígított 3 ml ásványi olaj 3 ml az adjuváns vizes oldata 1,5 ml Több héten át stabil szuszpenziót tartunk fenn. mikoris a fenti keveréket Ultra-Turrax készülékkel tartjuk szuszpenzióban. A nyulakat (Buscat fehér óriás) (2-3 kg súlyúak) comjukon intramuszkulárisan 2 ml fenti emulzióval oltjuk be. 3 hét múlva ugyanezen emulzióval emlékeztető injekciót kapnak, azonos mennyiségben és ugyancsak intramuszkulárisan. Két héttel ezután az állatok fültövén elhelyezkedő eret megnyitjuk, és a B/Mass./3/66 influenzavírus hatására keletkezett véralvadás gátló antitesteket (IHA) a kapott szérumban megtitráljuk. b) Irodalom 1. D. Hobson, Immunobiol. Standard. 6. 269-274 (1967). 2. F. M. Davenport és A. V. Henessy, Immunobiol. Standard, 6, 283-294 (1967). 3. G, K: Hirst, J. Exp, Med.. 75. 49-64 (1942). c) Eredmények Az alábbi táblázatban a kapott szerológiai eredményeket foglaljuk össze, az IHA titerében meghatározva. Mindig három párhuzamos kísérletet végzünk. Alkalmazott adjuváns Az IHA titere ásványi olaj I ásványi olaj + H37 Ra-val elölt bacillus ^ ásványi olaj + a találmány szerinti adjuváns 4 III. A találmány szerinti termék nem mutat artrogén hatást, ugyanakkor a complet Freund-adjuvánssal 5 kezelt állatoknál ilyen hatás fellép. Összefoglalva megállapítható, hogy a találmány szerint extrahált adjuvánsok a complet Freund-adjuvánstól abban különböznek, hogy úgy növelik az antitestek termelését, hogy ugyanakkor lényegesen 10 kisebb a késleltetett típusú túlérzékenységre gyakorolt hatásuk. (I. táblázat.) Ez igen nagy jelentőségű bizonyos terápiás területeken, például vakcina-adjuvánsok esetén, amikor a késleltetett típusú túlérzékenység fokozása hátrányos lehet. Ezért a találmány 15 szerinti vízoldható kivonat igen előnyös, mivel alkalmas az antitest-termelésre, ugyanakkor a túlérzékenységet gyakorlatilag nem befolyásolja. 20 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás kis molakulasúlyú, diaminopimelinsavat tartalmazó vízoldható acetilezett termék előállítására Corynebacterium parvum sejtekből, melynek mole-25 kulasúlya 1000 ± 200 és 8000 ± 200 között van és a Corynebacterium parvum sejtfalainak adott esetben nem-aminált redukáló cukrokkal társult vízoldható acetilezett részeiből, főleg acetilezett diszacharid-tetrapeptid és acetilezett tetraszacharid-heptapeptid 30 elegyéből vagy ezeknek acetilezett nem-aminált redukáló cukrokkal alkotott elegyéből áll, azzal jellemezve, hogy diaminopimelinsavat tartalmazó Corynebacterium parvum sejtek zsírtalanított baktériummaradékát acetilezzük és a vízoldható kivona-35 tokát fizikai-kémiai módszerekkel izoláljuk, majd adott esetben tisztítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az acetilezést ecetsavanhidrid-piridin-eleggyel végezzük. 40 3.. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az acetilezést olyan ecetsavanhidrid-piridin-eleggyel, amely 2 térfogat ecetsavanhidridet tartalmaz 3 térfogat piridinre számítva, 20 C° és 35 C° közötti hőmérsékleten 45 50-75 óra alatt vitelezzük ki. 4. Az 1-3. igénypont bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a vízoldható terméket a baktériummaradék acetilezésével kapott elegy alkohollal, majd vízzel való 50 extrahálásával és a kivonat liofilizálásával izoláljuk. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy alkoholként etanolt használunk, 55 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az etanollal való kezelés során az oldhatatlan részt eltávolítjuk, a felülúszó etanolos részt szárítjuk, a maradékot desztillált vizben felvesszük, a vízben oldhatatlan frakciót elválasztjuk 60 és az így kapott felülúszó vizes réteget liofilizáljuk. 7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a vízoldható kivonatokat szűréssel és/vagy adszorben-65 seken történő kromatografálással tisztítjuk. 4
