171392. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kis molekulasúlyú, diaminopimelinsavat tartalmazó vízoldható acetilezett termékek előállítására, Corynebacterium parvum sejtekből
3 171392 4 - az alkoholos oldatot betöményítjük, - a kapott maradékot desztillált vízzel kezeljük, - a vízben oldhatatlan frakciót centrifugálással elkülönítjük, és - a felülúszó vizes réteget, amely azokat a vízoldható acetilezett termékeket tartalmazza, amelyek alkohol-piridin-elegyben és vízben egyaránt oldhatók, liofilizáljuk. A találmány szerinti eljárás folyamán alkohol-piridin-elegyként előnyösen 10:1 tf arányú etanol-piridin-elegyet alkalmazunk. A centrifugálás valamennyi lépcsőjét alacsony hőmérsékleten, mégpedig 0—6 C°-on, hajtjuk végre, A találmány egy különösen előnyös változatánál a találmány szerinti vízoldható termékeket adott esetben tisztítjuk és megfelelő fizikai-kémiai módszerekkel, így adszorbenseken, előnyösen DEAE-cellulózon, amely ,,DEAE-BiogelA"' néven ismert a kereskedelemben, történő kromatográfiával tisztítjuk. Végezhetjük azonban a tisztítást szűréssel is, erre a célra valamely poliakrilamidgélt, például „Biogel P10" „Biogel P6" vagy „Biogel P4" kereskedelmi néven ismert terméket használunk. (Bio-Rad Lab., Richmond, Calif,) Az így kapott vízoldható termék lényegében a sejtfal vízoldható acetilezett részeinek, amelyek adott esetben nem-aminált acetilezett redukáló cukrokkal vannak társulva, változó arányú elegye. A találmány szerinti vízoldható termékben levő sejtfal vízoldható részeinek a mennyisége a találmány szerinti eljárás kivitelezésének sajátságos körülményeitől és elsősorban a tisztítás módjától függően változik. A sejtfal vízoldható részeit lényegében egy diszacharid-tetrapeptid, egy tetraszacharid-heptapeptid és ez utóbbi dimer, trimer és tetramer származékai alkotják. A diszacharid-tetrapeptid a következő molekula-összetétellel rendelkezik: N-acetilglukózamin (1), N-acetilmuraminsav (1), alamin (2), glutaminsav (1), diaminopimelinsav (1), és a következő szerkezeti képlettel írható le: NAG-NAM Ala-Glu-DAP-Ala A tetraszacharid-heptapeptid a következő összetevőkből áll: N-acetilglukózamin (2). N-acetilmuraminsav (2). alanin (3), glutaminsav (2), diaminopimelinsav (2), és a következő szerkezeti képlettel ábrázolható: NAG-NAM-NAG-NAM I I Ala Ala I I Glu Glu ! I DAP DAP I Ala Ezekben a képletekben NAG = N-acetilglukózamin NAM = N-acetilmuraminsav Ala = alanin 5 Glu = glutaminsav DAP = diaminopimelinsav Bizonyos részekben a DAP szabad sav- vagy amin-része aszparaginsav- és glicin-maradékkal helyet-10 tesíthető, amelyek egymással kapcsolatban levő hídtagok, és természetesen a sejtfalban fordulnak elő« A nem-aminált redukáló cukrokat lényegében a glukóz, mannóz és esetleg a galaktóz alkotja. 15 Az így kapott vízoldható termék összetételét szokásos módszerekkel, így az aminosavak, aminocukrok és nem-aminált redukáló cukrok meghatározása útján állapítjuk meg. Az előzőekben megadott tisztítási művelet útján a 20 találmány értelmében olyan vízoldható terméket állíthatunk elő, amelyek lényegében acetilezett tetraszacharid-heptapeptidet tartalmaznak önmagában vagy nem aminált acetilezett redukáló cukrokkal együtt. így a találmány szerinti eljárás során 25 kapott nyers, vízoldható termék, például Biogel P10-en való szűrés, ezt követően DEAE-Biogel A-n történő kromatografálás és megfelelően választott oldószerekkel, például hígított ecetsavval vagy piridin-ecetsav-eleggyel való eluálás után, olyan acetilezett 30 anyagokat szolgáltat, amelyek acetilezett diszacharid-tetrapeptidet, acetilezett tetraszacharid-heptapeptidet, valamint ennek dimer. trimer és tetramer származékát, nem-aminált acetilezett redukáló cukrokkal együtt tartalmaznak, A szűrés és a kromatog;5 rafálás során a vízoldható anyagokat csökkenő molekulasúlyuk sorrendjében különítjük el Mivel a találmány szerinti vízoldható termékek aktivitása a diaminopimelinsav jelenlétével kapcso-40 latos, különösen hasznos az. hogy a nyers elegyből kiindulva elkülönítsük az olyan anyagokat, amelyek elég nagy mennyiségben vannak jelen és amelyeknek nagy a diaminopimelinsav-tartalmuk. Különösen fontos, hogy nyers vízoldható kivonatokból kiindulva 45 olyan vízoldható terméket izoláljunk, amelyek főképpen acetilezett tetraszacharid-heptapeptidet tartalmaznak esetleg nem-aminált redukáló cukrokkal együtt, A kapott találmány szerinti vízoldható acetilezett 50 termékek értékes immun-hordozó tulajdonságokkal rendelkeznek anélkül, hogy arthrogen hatást mutatnának. Az immun-hordozóként való alkalmasságot Hartley fajta tengerimalacon a R. G. White és mtsai. által 55 kidolgozott és az Immunology, 7, 158 (1964) folyóiratban leírt módszerekkel, az arthrogen- és védőhatást pedig a F. Bonhomme által a C. R. Acad. Sei., D sorozat, 263,1422 (1966) es C. R. Acad. Sei., D sorozat, 265, 2115 (1967) irodalmi helyeken 60 ismertetett módon határozzuk meg. A tengerimalacnál a találmány szerinti vízoldható termékek 0,1 mg-os vagy ennél nagyobb adagok bőr alá történő beadás esetén az antitestek mennyisé-65 gének a megnövekedését okozzák. 2
