171384. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív pteridin-származékok előállítására
9 171384 10 Darco-G-60'-t adunk, majd a csöveket 10 percig időnként rázogatjuk. Az aktív szenet Millipore AP 250—2200'-típusú szűrő alkalmazásával eltávolítjuk, a szűrőt háromszor 10 ml hideg vízzel mossuk. Ezt követően vizsgáljuk az aktív szén és a szűrő 5 radioaktivitását. A 2-es és 3-as vizsgálati edényben levő anyagok radioaktivitását vesszük maximális értéknek, minthogy ezek a csövek vizsgálati anyagot nem tartalmaztak, ily módon az enzim inhibitáció 10 értéke 0 volt. A többi vizsgálati edényben mért radioaktivitás értékét az előbbi maximumhoz viszonyítjuk és az inhibitációt %-ban adjuk meg. A 10-12-es vizsgálati edények tartalmát a b) pontban leírtak szerint kromatográfiásan vizsgál- 15 juk. A 10-es és 1 l-es edények nem tartalmaznak vizsgálati anyagot, az inhibitáció mértéke 0% ezért ezt az értéket 100%-nak vesszük. A b) ponthoz tartozó edények tartalma által kifejezett inhibitáció %-át ehhez az értékhez viszonyítjuk. 20 b) Az I általános képletű vegyületnek szintetázzal szemben kifejtett hatását a dihidropteroát—C14 képződés segítségével határozzuk meg. Pteridin elegyet készítünk oly módon, hogy 25 semleges ATP-t (50//liter, 0,1 mól), MgCl2 -6H 2 0-t (50//liter 0,1 mól) ditiotreitolt (lOOjuliter, 0,1 mól), trisz-puffert (100//liter 0,4 mól 8,3 pH), HMPt (25 //liter 876/(mól) és 170//liter HMPPS-t elegyítünk. Az elegyet 30 37 C°-on 60 percig inkubáljuk, jéggel lehűtjük, majd az oldathoz szobahőmérsékleten 100 //liter dextrózt (72,1 mg/ml) és 20 //liter hexokinázt (200 egység/ml) adunk, majd az oldatot 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. 35 Az eljáráshoz az alábbi oldatot készítjük el: 10//liter MgCl2 -6H 2 0 (0,1 mól), 10//liter pAB-C14 (0,4 mmól), 20//liter ditiotreitol (0,1 mól) és 20//liter trisz-puffer (0,4 mól, 8,3 pH) és 5 vizsgálati edény mindegyikébe ezt adjuk. Az 40 előbbi szakasz szerint előállított pteridin elegyből 80//litert, majd szintetázt és/vagy valamely I általános képletű vegyületet adunk a vizsgálati edényekhez. Az oldatot desztillált vízzel 200 //literre kiegészítjük. 45 A vizsgálathoz két kontroll edényt készítünk. Az edényekbe 10//liter ATP (0,1 mól), 10 //liter MgCl2 -6H 2 0 (0,1 mól), 20//liter ditiotreitol (0,1 mól), 20//liter trisz-puffer (0,4 mól 8,3-as pH), 10//liter pAB-C14 ,(0,4 mmól) és 20 //Hier HMPPS 50 és ismert aktivitású szintetáz oldatát helyezünk. A vizsgálati anyagot az egyik edényhez 10~5 mól koncentrációban adjuk, majd mindkét edényt desztillált vízzel 200 //literre kiegészítjük. ' .. 55 Mind a hét vizsgálati edényt 37 C°-on 30 percig inkubáljuk, jégen hűtjük, majd az a) pont szerint leírt 10—12-es kontroll edényekkel együtt a vizsgálati mintákat kromatográfiás ellenőrzésnek vetjük alá. 60 Minden egyes vizsgálati edényből 100//litert 3MM jelzésű Whatman , papírra (2 x 20 cm méret) viszünk fel, futtatószerként kálium és nátriumfoszfát Sörensen puffer-oldatot (0,1 mól 7,0 pH) alkalmazunk. A futtatást 10—15 cm hosszúságban 65 végezzük. A szintetáz inhibitációjának mértékét a 10-es és a 11-es kontroll edényeknél, mért értékekhez viszonyítva a foltok viszonylagos távolságából állapítjuk meg. A kontroll edényekben levő anyag inhibitációja 0%. A találmány szerinti vegyületek 100 //m ól koncentrációban 50%-os inhibitációt mutatnak. 6,6 //mól koncentráció értéknél a 2-amino-4-hidroxi-7,7-dietil-7,8-dihidropteridin-6-karboxaldehid és e vegyület 7,7-dimetil analógja 50%-os inhibitációs hatást fejt ki. 7. példa 2-Amino-4-hidroxi-7-spirociklopentil-7,8--dihidropteridin-6-karboxaldehid [Az (la) általános képletben Rí, R2 =spirociklopentil-csoport] 0,5 g 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetil-7-spirociklopentil-7,8-dihidropteridint [A (Ha) általános képletben Rh R 2 = spirociklopentil-csoport] 150 ml forró dimetilszulfoxidban oldunk, és 2,0 g aktivált mangándioxidot (amelyet szénre vittünk fel) adunk hozzá. A szuszpenziót 4 órán át keverjük 100C°-on, majd melegen szűrjük. A maradékot 50 ml dimetilszulfoxiddal mossuk, a szűrletet és a mosófolyadékot egyesítjük, és vákuumban bepároljuk. A sötétszínű maradékot víz és izopropanol elegyéből átkristályosítjuk. 0,29 g (58%) cím szerinti vegyületet kapunk, sárga, kristályos anyag alakjában, amely 300 C° felett megsötétedik. A termék a vékonyrétegkromatográfiás (szilikagél réteg, futtatószer kloroform és metanol 3 : 1 arányú elegye) és a papírkromatográfiás (futtatószer propán-l-ol, víz és ammónia 40 :20 : 1 arányú elegye) vizsgálat során egyetlen foltot ad. Elemanalízis: számított: C =51,56%, H =5,51%, N =27,33%, talált: C =51,68%, H =5,50%, N =26,66%. 8. példa 2-Amino-4-hidroxi-7-spirociklopentil-7,8--dihidropteridin-6-karboxaldehid [Az (la) általános képletben Rj, R2 = spirociklopentil-csoport.] • 0,9 g 2-amino-4-hidroxi-6-[l-(2-hidroxi-l-hidroxi-imino-etil)-ciklopentilamino]-5-nitro-pirimidint [a (Illa) általános képletben Rj, R2 = spirociklopentil-csopoít] 5 ml etanolban és 10 ml vízben oldunk, az oldatot 60C°-ra melegítjük, és ezen a hőmérsékleten 3,0 g nátriumditionitot adunk hozzá részletekben, 15 perc alatt. Az adagolás közepén kristáykiválás indul meg. A reakcióelegyet további 5
