171383. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunogén anyagok elkülönítésére Pasteurella Haemolytica vagy Pasteurella multocida törzsekből és ezeket tartalmazó vakcina előállítására

11 171383 12 csökkenni kezd (8 óra elteltével), a levegőztetést megszüntetjük, és a tenyészetet 4 C°-ra hűtjük. így a növekedést leállítjuk. 3 liter így kapott tenyészethez a sejtek elölése céljából 10vegyes% etil-merkuri-tio- szalicilsavat adunk, az elegyet 150 liter desztillált vízzel szemben dializáljuk, majd fagyasztva szárítjuk. A liofilizátumot 200 ml desztillált vízben szuszpendáljuk, és 600 ml metanollal kezeljük. A csapadékot Whatman No. 1 szűrőpapíron kiszűrjük. A szűrlethez 2,4 liter acetont adunk, és az elegyet a csapadék kiválásának teljessé tétele érdekében éjszakán át 4C°-on tartjuk. Az acetont dekantálással eltávolítjuk, majd az aceton maradékainak eltávolítása érdekében levegőt fúvatunk át a szilárd immunogén anyagon. A kapott szilárd anyagot desztillált vízben oldjuk, és az oldatot fagyasztva szárítjuk. Az így kapott termék tulajdonságait az alábbiakban ismertetjük. (Megjegyezzük, hogy a fizikai állandók meghatározása előtt a terméket a 6., illetve a 9. példa szerinti módon tovább tisztítjuk.) A termék tulajdonságai: 1, Általános jellemzők: A kapott termék halványsárga por, desztillált vízben vagy fiziológiás sóoldatban (0,85 vegyes%-os vizes nátriumklorid-oldat) legalább 200 mg/ml koncentrációban oldódik, és átlátszó, sárga oldatot képez. Az oldat optikai sűrűsége 280 nm-en kisebb 0,05-nél. Desztillált vízzel készített 0,5 mg/ml koncentrációjú oldatában csúcs vagy inflexió nem észlelhető, A poliakrilamid-gélre felvitt immunogén anyag (30 mg poliszacharid/ml 7%-os poliakrilamid-gél) a szokásos színezékekkel, például Coomassie-brilliáns-kékkel vagy naftalin-feketével nem festődik, azonban perjódsav-schiff-színezékkel (szénhidrát-színezék) és alcian-kékkel (polianion-színezék) festődik, A 20 percig 66C°-on 45%-os vizes fenol-oldattal kezelt, illetve vízben 10 percig forralt immunogén anyag immundiffúziós kísérletben teljesen azonos reakciót ad a kezeletlen mintával, 2. Toxicitás A liofilizátumot toxicitás vizsgálat céljára pirogén anyagtól mentes steril sóoldatban oldjuk. Az oldat koncentrációja 50 mg/ml. Az oldatból sorozathígítást készítünk, az egyes hígításokat intravénás injekcióban 11 napos csirkeembrióknak adjuk be, és feljegyezzük a pusztulási arányt, E kísérletben az LD50-érték 2,2 mg. A liofüizátum 0,85 vegyes%-os, pirogén anyagtól mentes vizes nátriumklorid-oldattal készített különböző koncentrációjú oldatait intradermánális injekció formájában fehér/ nyulaknak adjuk be, majd 24 óra elteltével á nyulaknak intravénás injekcióban lOOjug endotoxin! adunk. Az endotoxin az Ann. Inst. Pasteur, Paris, 98, 789 (1960) szakcikkben leírt módon állítjuk elő. 24 óra elteltével megszámláljuk a nyulak bőrén megjelenő véres, elhalt foltokat. E kísérletben a szenzibilizáló dózis 0,25 g. 5 A pirogén dózis közelítő meghatározása során az immunogén anyag fentiek szerint hígított oldatait intravénás injekció formájában nyulaknak adjuk be, és 5 órán keresztül feljegyezzük az állatok végbélben mért hőmérsékletét. A közelítő pirogén 10 dózis kb. 0,1 mg. 3. Antigén hatás — immunogén hatás 15 Az immunogén anyag a teljes sejt-vakcinával immunizált szarvasmarhák vérsavójából elkülönített teljes sejt-antiszérumból az egéren védőhatást kifejtő antitestek 96%-át abszorbeálja. Ez azt jelzi, hogy az immunogén anyag védőhatás kifejtésére 20 alkalmas, A kísérletet Carrel és Barundun módszerével végezzük [Immunochemistry 8, 39 (1971)], úgy, hogy a poliakrilamid-gélre 250 mg antigént viszünk fel. A kísérletben 12,5 ml szérum abszorbeálódik. 25 Az immunogén hatást szarvasmarhán vizsgáljuk. 12,5 mg immunogén anyagot 1,5 ml steril fiziológiás sóoldatban oldunk, és az oldathoz 0,5 ml 25%-os steril Alhydrogel-t (a Superfos Export, Dánia cég terméke) adunk. A kapott 2 ml 30 térfogatú készítményt szubkután úton 2—2 borjúnak, illetve 2-2 tehénnek adjuk be. 2 hét elteltével a kezelést azonos anyaggal és azonos dózissal megismételjük, és további 2 hét elteltével megvizsgáljuk az állatok immunitását. Az immunitásvizsgálat során az 35 állatok vérmintájából elkülönített vérsavó fertőzött egéren kifejtett védőhatását vizsgáljuk. E vizsgálat szerint mindkét tehénben és az egyik borjúban kifejlődött bizonyos mértékű immunitás. 40 Az immunogén hatást egéren is megvizsgáljuk. 10 jug immunogén anyagot adjuvánsmentes szubkután injekcióban egereknek adunk be, majd 16 nap elteltével a kezelést megismételjük. A második kezelést követő 14. napon az egereket kb. 45 100 élő fertőző mikroorganizmussal fertőzzük meg. Az egerek 80%-a védett marad. 2. példa 50 Immunogén anyag előállítása B típusú tokos sejtekből Az immunogén anyagot az 1. példában leírt 55 eljárással állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy az etil-merkuri-tio-szalicilsav adagolását, az elölt tenyészet dialízisét és a dializált tenyészet liofilizálását elhagyjuk, minthogy a metanol adagolása önmagában is elegendő a mikroorganizmusok 60 elöléséhez. Az újraoldás desztillált vízben, a végső acetonos kicsapás és a kapott oldat liofilizálása ugyancsak elmarad. A fentiek szerint előállított anyag általános 65 jellemzői megegyeznek az 1. példában közöltekkel. 6