171383. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunogén anyagok elkülönítésére Pasteurella Haemolytica vagy Pasteurella multocida törzsekből és ezeket tartalmazó vakcina előállítására
5 171383 6 nogén hatóanyagot. Az „endotoxin-mentes" megjelölésen olyan anyagokat értünk, amelyek az endotoxinra jellemző toxicitási tüneteket gyakorlatilag nem váltanak ki. A kiindulási P. multocida vagy P. haemolytica 5 sejteket a vérmérgezésben, baromfi-kolerában vagy más .pasteurella-fertőzésben szenvedő emlősök vagy szárnyasok véréből vagy egyéb testnedvéből vagy szövetéből különíthetjük el. A fertőzött vért, testnedvet vagy szövetet tárolás céljából adott 10 esetben liofilizálhatjuk, általában azonban felhasználásig folyékony nitrogénben tároljuk. Az immunogén anyag előállításához bármilyen ismert, és ismert módszerrel előállított tokos mikroorganizmus-tenyészetet felhasználhatunk. Elő- 15 nyösen úgy járunk el, hogy a megfertőzött vért a tenyésztés első lépésében néhány órán át megfelelő táptalajon, például tápagaron tenyésztjük. Ekkor a kifejlődött tokos P. multocida vagy P. haemolytica sejteket ferdén beeső fényben mutatott fényvissza- 20 verésük alapján különböztethetjük meg. Ezután a fényvisszaverő sejttelepeket eltávolítjuk a táptalaj felületéről, és a következőkben ismertetésre kerülő steril táptalajon tenyésztjük. A 25 tenyésztést rendszerint a logaritmikus növekedési szakasz lezajlásáig, előnyösen a maximális hozam eléréséig végezzük. A tokos P. multocida vagy P. haemolytica sejteket ismert módon tenyészthetjük (lásd J. Bact. 30 93, 7-14, Appl. Microbiol. X9, 837-841, Z. Alig. Microbiol. 14, 29-38). A tenyésztéshez a sejtnövekedést elősegítő valamennyi szokásos táptalajt felhasználhatjuk. A tenyésztést előnyösen levegőztetés közben végezzük, azaz a tenyészeten 35 steril levegőt vezetünk át. így például a sejteket agáron vagy kémiailag meghatározott táptalajon, például Wessman-táptalajon [Wessman G. E. és Wessman G.: Can. J, Microbiol. 66, 751 (1970)] tenyészthetjük. Táptalajként előnyösen a Sterne és 40 munkatársai által ismertetett pufferolt közeget alkalmazzuk [Sterne M., Hutchinson I.: Brit. Vet. J. 114, 116 (1958)]. Annak érdekében, hogy a lehető, legrövidebb idő alatt maximális növekedést érjünk el, a mikroor- 45 ganizmust előnyösen egymás után több szubkultúrában tenyésztjük. Az egyes szubkultúrák oltóanyagait előnyösen a logaritmikus növekedési szakaszban különítjük el. Az inokulum mennyisége előnyösen a következő tenyészet 10%-a lehet. A 50 tenyésztést folyamatos eljárással, például Sterne és munkatársai módszerével [Sterne M„ ós Hutchinson I.: Brit. Vet. J. 114, 116 (1958)] is végezhetjük. A fermentlé frakcionálása előtt előnyösen 55 megvizsgáljuk a tokos sejteket és táptalajt tartalmazó elegy tisztaságát és a nem-tokos variánsok jelenlétét. A vizsgálatot például agáron végezhetjük, mikroszkópos és makroszkópos módszerekkel 60 Ha az immunogén anyagot a tenyésztési közegből kívánjuk elkülöníteni, a kívánt mértékű növekedés elérése után a tenyészetet néhány napig állni hagyjuk, amikor az immunogén anyag a tokos sejtekből a tenyésztési közegbe jut. 65 A teljes sejttenyészet, oldott sejttenyészet, elkülönített sejtek, feloldott sejtek vagy sejtmentes tenyésztési közegek frakcionálását a következőképpen végezzük: A frakcionálandó anyagot hidrofil oldószerrel, előnyösen rövidszénláncú alkanollal vagy rövidszénláncú alkil-ketonnal kezeljük. A hidrofil oldószert addig adjuk az elegyhez, amíg az endotoxin lényegében teljes mértékben kiválik, azonban az immunogén anyag kiválása még nem kezdődik meg. Ezzel az eljárással endotoxin-mentes felső folyadékfázist kapunk. Rövidszénláncú alkanol oldószerként előnyösen primer alkoholokat, célszerűen metanolt vagy etanolt használunk. A rövidszénláncú alkil-ketonok közül az aceton és a metil-etil-keton bizonyult a legcélszerűbbnek. A hidrofil oldószer optimális koncentrációját előkísérletekkel könnyen meghatározhatjuk. Az előkísérletek során például úgy járunk el, hogy a hidrofil oldószert egymást követő kis részletekben hozzáadjuk a frakcionálandó anyagot tartalmazó vizes közeghez, az egyes részletek hozzáadásakor képződött csapadékot elkülönítjük, majd megvizsgáljuk az elkülönített csapadék sajátságait (például toxicitását és immunogenicitását). Ezzel a kísérlettel könnyen meghatározhatjuk azt az optimális oldószer-mennyiséget, amelynek beadagolásakor az endotoxin teljes mértékben kiválik, az immunogén anyag azonban még nem. A frakcionálás optimális körülményei az oldószertől és az immunogén anyag forrásaként felhasznált P. multocida vagy P. haemolytica törzstől és fajtól függően változnak. így például, ha az endotoxin leválasztásához hidrofil oldószerként metanolt használunk, és hatóanyag-forrásként B vagy E sejtekből indulunk ki; az optimális metanol-koncentráció 50-80 térf.%, míg ha A vagy D sejtekből indulunk ki, az optimális metanol-koncentráció 30-55 térf.%. Hidrofil oldószerek helyett a liotróp-sor magasabbrendű sóit (azaz hidrofil kolloidok oldatukból való kisózására alkalmas anyagokat) is felhasználhatjuk. Különösen előnyös sónak bizonyult az ammóniumszulfát. A kisózáshoz felhasznált só optimális koncentrációját a fentihez hasonló előkísérletekkel könnyen meghatározhatjuk. Az endotoxin kiválásának maximálissá tétele érdekében előnyösen a só vagy hidrofil oldószer és a tenyészet elegyét néhány órán át állni hagyjuk. Az optimális állásidő természetesen a só vagy a hidrofil oldószer jellegétől és koncentrációjától is függ. Az elegyet általában 6-24 órán át, rendszerint körülbelül 18 órán át hagyjuk állni. Ezalatt az elegyet előnyösen 10 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten, például 0-10C°-on, így körülbelül 4 C°-on tartjuk. Az endotoxin-mentes felső folyadékfázist ismert módon, például centrifugálással, szűréssel, dekantálással vagy leszívatással különíthetjük el. Ezután az endotoxin-mentes folyadékfázist a fent ismertetett hidrofil oldószerrel kezeljük. Az oldószert olyan mennyiségben adjuk a folyadék-3
