171383. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunogén anyagok elkülönítésére Pasteurella Haemolytica vagy Pasteurella multocida törzsekből és ezeket tartalmazó vakcina előállítására

7 171383 8 fázishoz, hogy az immunogén anyag kiváljon. A hidrofil oldószer optimális koncentrációját például a korábban ismertetett előkísérlettel egyszerűen meghatározhatjuk. Az immunogén anyag kicsapásához hidrofil oldószerként előnyösen acetont használunk. Ha immunogén anyag-forrásként B vagy E típusú sejteket alkalmaztunk, a folyadékfázishoz 50-80 térf.%, előnyösen 75 térf.% acetont adunk. Az immunogén anyag kicsapásához hidrofil oldószerként metanolt is előnyösen alkalmazhatunk. Ha az eljárásban B vagy E típusú sejtekből indultunk ki, a folyadékfázishoz 70—80 térf.%, előnyösen körülbelül 75 térf„% metanolt adunk, míg ha A típusú sejtekből indulunk ki, a kicsapáshoz 40-70 térf.%, előnyösen körülbelül 66 térf.% metanolt használunk fel. Az immunogén anyag kicsapásához a liotróp-sor magasabbrendű sóit is felhasználhatjuk. Az immunogén hatóanyag kicsapásához nagyobb mennyiségű sóra van szükség, mint az endotoxin eltávolításához. Sóként különösen előnyösen alkalmazhatunk ammóniumszulfátot. Ha az endotoxint az első lépésben sóval csaptuk ki, eljárhatunk úgy is, hogy a második lépésben a sót például desztillált vízzel szemben végzett dialízissel eltávolítjuk a folyadékfázisból, és ekkor az immunogén anyag vizes oldatához jutunk. Az endotoxin eltávolításához és az immunogén anyag kicsapásához azonos hidrofil oldószert is felhasználhatunk, nyilvánvaló azonban, hogy az immunogén anyag kicsapásához nagyobb mennyiségű hidrofil oldószerre van szükség, mint az endotoxin eltávolításához. Az endotoxin eltávolításához felhasznált oldószernek továbbá általában nem mindig kell kisebb affinitással rendelkeznie a vízhez, mint az immunogén anyag kicsapásához felhasznált oldószernek vagy sónak. Az immunogén anyag kiváásának teljessé tétele érdekében rendszerint úgy járunk el, hogy az endotoxin-mentes folyadékfázis és a hidrofil oldószer (vagy só) elegyét néhány órán át állni hagyjuk. Az optimális állásidő természetesen az immunogén anyag és a kicsapószer jellegétől, illetve koncentrációjától függően változik. Az elegyet rendszerint 6—18 órán át, előnyösen körülbelül 12 órán át hagyjuk állni, és ezalatt 10C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten, például 0—10C°-on, így 4 C°-on tartjuk. Az utóbbi műveletben képződött felső folyadékfázist ismert módszerekkel, például centrifugálással, szűréssel, dekantálással vagy leszívatással távolíthatjuk el. A kapott anyagból előnyösen ismert módon eltávolítjuk a só vagy hidrofil oldószer nyomait. Az illékony hidrofil oldószereket, például az acetont rendszerint úgy távolíthatjuk el, hogy az immunogén anyagon steril levegőt fúvatunk át. Az így kapott immunogén csapadékot ezután megfelelő mennyiségben oldjuk a vakcinakészítéshez szükséges oldószerben, majd a vakcinát sterilizáljuk és az immunizálandó emlős vérével izotóniássá tesszük. Előnyösen úgy járunk el, hogy a csapadékot aszeptikus körülmények között steril oldószerben oldjuk. Az injekciós oldatokat ismert módon sterilizálhatjuk, például úgy, hogy az oldatot Millipore GS membránon (pórusméret: 0,22 ju) keresztül szűrjük. Az injekciós oldatot ismert módon tehetjük izotóniássá, például úgy, hogy az 5 immunizálandó emlős vérével azonos ozmózis-nyomással rendelkező sóoldattal szemben dializáljuk. Oldószerként az immunizációs közegekhez általában felhasználható anyagokat, például 0,85 vegyes%-ós vizes nátriumklorid-oldatot vagy izotóniás 10 foszfátpuffer-oldatot használhatunk fel. Az így kapott vakcinát a felhasználás előtt hígítandó vagy a felhasználási célnak megfelelő koncentrációjú készítmény formájában hozhatjuk forgalomba. Az utóbbi esetben az oldat általában 15 1-100 mg/ml, előnyösen körülbelül 10 mg/ml mennyiségű immunogén anyagot tartalmaz. Pasteurella-fertőzés elleni immunizáláshoz az immunogén anyagot általában 1-100 mg, előnyö-20 sen 2—20 mg dózisban használjuk fel. B és E típusú immunogén anyagok esetén a legcélszerűbb dózis körülbelül 7,5 mg. így dózis általában 0,1—10 ml, célszerűen 1—5 ml, előnyösen körülbelül 2 ml injiciálható oldatból áll. 25 A találmány szerint előállított vakcinát bármilyen ismert módon beadhatjuk, a vakcina pontos összetétele és jellege természetesen a beadás módjától függően változik. A vakcinát előnyösen injekció, célszerűen intramuszkuláris vagy szubku-30 tán injekció formájában adjuk be. Kívánt esetben az injekciós oldathoz adjuvánsokat is adhatunk. Bármilyen ismert adjuvánst felhasználhatunk, előnyösen azonban alumíniumsókat, így alumíniumhidroxid-gélt, például Alhydro-35 gel-t (a Superfos Export Co., Dánia cég gyártmánya) alkalmazhatunk. Az immunogén anyagot víz-az-olajban emulzió formájában is kikészíthetjük amely az immunogén anyagot a vizes fázisban tartalmazza. A vakcina 40 előnyösen lipofil és/vagy hidrofil emulgeálószert tartalmaz. Az injiciálható oldatokhoz előnyösen konzerválószereket, például fenolt vagy etil-merkuri-tio-szalicilsavat adunk. Az immunogén anyagot adott esetben több-45 komponensu vakcinák egyik komponensekét is felhasználhatjuk. Ezek a vakcinák további komponensként egyéb emlősök és szárnyasok kórokozói elleni antianyagokat tartalmaznak. Az immunogén anyagot például az 1 143 545 sz. Nagy-Britannia-i 50 szabadalmi leírásban ismertetett víz-az-olajban típusú emulzióhoz vagy káliumaluminát adjuvánst tartalmazó készítményekhez adhatjuk egyik komponensként. E vakcinák további komponensekként Clostridium-antigéneket tartalmaznak. Az immuno-55 gén anyagot ezen kívül bovin-parainfluenza-vírus és bovin-adenovírus szuszpenziójához vagy víz-az-olajban típusú emulziójához adhatjuk további vízben oldódó komponensként. így például a tokos B vagy E típusú sejtekből 60 származó immunogén anyagot további komponensként Anthrax Spores vakcinához (például „Blanthax" vakcinához, a The Wellcome Found. Ltd. cég terméke) vagy Clostridium chauvoei vakcinához adhatjuk, vagy a tokos A vagy D típusú sejtekből 65 származó immunogén anyagot Clostridium chauvoei 4