171383. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunogén anyagok elkülönítésére Pasteurella Haemolytica vagy Pasteurella multocida törzsekből és ezeket tartalmazó vakcina előállítására
3 171383 4 teljes sejteket vagy sejtfrakciókat tartalmazó vakcinákkal beoltott emlősökön és szárnyasokon különféle káros hatásokat vált ki. Az endotoxin komponens pontos szerkezete ma még nem ismert, feltételezik azonban, hogy ez az anyag lipo-poliszacharid. A találmány szerinti eljárással egy adott típusú P. multocida vagy P. haemolytica sejtből egy adott immunogén anyagot különítünk el. A kapott immunogén anyag tisztasági foka az alkalmazott tisztítási műveletektől függően változhat (így például a B-típusú tokos P. multocida-sejtekből B2-típusú, viszonylag szennyezett immunogén anyagot, ez utóbbi anyag tisztításával pedig Bl-típusú, az előzőnél tisztább immunogén anyagot kapunk), alapvetően fontos azonban, hogy még a kevésbé tiszta frakciók sem tartalmaznak éndotoxint. A kapott immunogén anyagok főbb jellemzői a következők: a) az immunogén anyagok P. multocida vagy P. haemolytica szérumtípusok tokos variánsaiból állíthatók elő, A hatóanyag előállításához felhasznált szérumtípusok azonosak azokkal a mikroorganizmus-szérumtípusokkal, amelyek ellen immunitást kívánunk kelteni, b) az immunogén anyagok a természetes P. multocida vagy P. haemolytica fertőzéssel szembeni immunizáláshoz szükséges dózisban emlősökre és szárnyasokra nézve nem toxikusak, c) antigén sajátságaikat 100C°-os vízben 10 percig kezelve is megtartják, d) nem dializálhatók, e) vízben oldódnak, és oldhatóságuk desztillált vízben előnyösen legalább 20 mg/ml, és f) lényegében nem tartalmaznak nem-tokos P. multocida és P. haemolytica variánsokat. Az immunogén anyagok toxicitása kisebb az olyan tokos P. multocida vagy P. haemolytica tenyészetek toxicitásánál, amelyekből az éndotoxint nem különítették el. Az immunogén anyagok toxicitása előnyösen a fenti tenyészet toxicitásának századrészét, célszerűen ezredrészét sem éri el. így az immunogén anyagok Milner és Finkelstein módszerével [Milner K. L., Finkelstein R.A.: J. Inf. Dis. 116, 529 (1966)] meghatározott LD50 értéke csirke-embrión előnyösen nagyobb 10/xg-nál, lokalizált Schwartzmann-reakcióban [Lee L., Stetson CA.: J. Exp. Med. Ill, 761 (I960)] észlelhető aktív dózisuk nagyobb 2 jug-nál, Milner és Finkelstein módszerével [Milner K. L., Finkelstein R.A.: J. Inf. Dis. 116, 529 (1966)] nyúlon, 5 ixg hatóanyag beadása esetén meghatározott pirogén indexük kisebb 20-nál, és intravénás adagolás esetén nyúlon meghatározott halálos dózisuk nagyobb 1 mg-nál. A fenti súlyadatok dializáit és fagyasztva szárított anyagokra vonatkoznak. A találmány szerint előállított immunogén anyagok antigén sajátságaikat 100C°-os vízzel 10 percig történő kezelés után is megtartják, és vízben oldhatóak maradnak, sőt az immunogén anyagok antigén sajátságai és oldódási jellemzői fehérje-denaturáló körülmények között (például 45 térf.%-os vizes fenol-oldattal 66 C°-on hirtelen összekeverve vagy 5 percig 1,05 kg/cm2 nyomáson kezelve) sem változnak. Az immunogén anyagok molekulasúlya 104 és 5 107 közötti érték, előnyösen 10 s-nél nagyobb. A mérést gélkromatográfiás úton végeztük [T. P. King: „Methods in Immunology and Immunochemistry", 2. kötet, 135. oldal, kiadó: C. A. Williams és M. W. Chase, Academic Press, New 10 York and London, (1968)], Sephadex-gél felhasználásával (a Pharmacia Ltd. cég, Uppsala, Svédország gyártmánya). Az a tény, hogy az immunogén anyagok nem dializálhatók, arra utal, hogy molekulasúlyuk nagyobb 104-nél. 15 Bár az immunogén anyag forrásaként bármilyen tokos P. multocida vagy P. haemolytica törzset felhasználhatunk, előnyösen olyan törzset alkalmazunk, amely az adott helyi fertőzések jellemző kórokozója. így például Európában vagy Észak-20 -Amerikában felhasználandó készítményekhez a baromfi-kolera, a szarvasmarhák pasteurella Pneumoniae-fertőzése és más pasteurella-fertőzések megelőzésére az immunogén anyag forrásaként olyan pasteurella-mikroorganizmust választunk ki, 25 amely az adott megbetegedés (pl. baromfi-kolera, pasteurella pneumonia stb.) kórokozója. A pasteurella-szérumtípusokra eddig még nem dolgoztak ki nemzetközileg is elfogadott, egységes 30 osztályozási rendszert. Az Európában és Észak-Amerikában uralkodó pasteurella-szérumtípusok a Carter-rendszer [Carter, G. R.: Amer. J. Vet. Res. 16, 481 (1955)] szerint az A és D típusba, a Roberts-rendszer [Roberts R. S.: J. Comp. Path. 35 57, 261 (1947)] szerint a III és IV típusba, és a Little-Lyon rendszer [Little P. A. és Lyon B. M.: Amer. J. Vet. Res. 4, 110-112 (1943)] az I és III típusba tartoznak. Az Afrikában és Ázsiában uralkodó szérumtípusok a Carter-rendszer szerint a 40 B és E típusba, a Roberts-rendszer szerint az I típusba, míg a Little-Lyon rendszer szerint a II típusba sorolhatók. Az egységesség érdekében a leírásban a továbbiakban a Carter-rendszerre hivatkozunk. 45 Hangsúlyozzuk azonban, hogy az itt a Carter-rendszer szerint megjelölt szérumtípusok azonosak a már rendszerekben más módon jelölt szérumtípusokkal, és a találmány szerinti eljárás ezekre azonos eredménnyel alkalmazható. 50 Az immunogén anyagot a tokos P. multocida vagy P. haemolytica sejtekből, a feloldott sejtekből vagy azokból a tenyésztési közegekből, amelyekben a fenti tokos sejteket tenyésztettük, kémiai frakcionálással különíthetjük el. 55 A találmány tárgya tehát eljárás emlősök és szárnyasok pasteurella-fertőzés elleni immunizálásra alkalmas vakcinák készítéséhez felhasználható immunogén anyag előállítására. A találmány szerinti eljárás során tokos P. multocida vagy P. 50 haemolytica sejteket tenyésztünk, a sejttenyészetből, a feloldott sejteket tartalmazó tenyészetből vagy a tenyésztési közegből kémiai úton kicsapjuk az éndotoxint, és az endotoxin-mentes felső folyadékfázisból szilárd állapotban vagy oldat 55 formájában kinyerjük az endotoxin-mentes immu-2
