171339. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12-vitamin tartalmú fermentlevek feltárására és sejtmentesítésére
7 171339 8 nyösen nátriumhidroxiddal lúgosítjuk, úgy a vas(III)-hidroxid eltávolítása után a fermentléből a BI2 -vitamin az adszorpciót követő eluálásnál az adszorbens felületéről könnyebben oldható le és dolgozható fel. Ily módon például az emulzióképződés elkerülhető. A találmány lényege abban foglalható össze, hogy a sejtek feltárását, és a B12 -vitamin kialakítását a feltárt sejtek és a feltárt sejtekből a fermentlébe kerülő, illetőleg az élősejtek anyagcseretermékei közül a fermentlében már eleve jelenlevő, és a feldolgozást zavaró anyagok vas(III)-kloriddal történő koaguláltatását, valamint a koagulátumoknak vas(III)-hidroxiddal történő lecsapását egymást követően, különválasztott lépésekben, szűk paraméter tartományon belül végezzük. A találmány haladó jellegét azzal támaszthatjuk alá, hogy például egy 21 300 gamma/1 B12 -vitamin tartalmú fermentlevet a 2 530 416 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint feldolgozva 31%-os kitermelést érünk csak el, a 144 389 számú magyar szabadalmi leírás 2. és 3. példája szerint eljárva olyan feltárt fermentlevet kapunk, amely nehezen szűrhető és a további lépésekben (például fenolkloroformos kivonatolás) nem dolgozható fel. Ezzel szemben, ha a találmány szerint járunk el, a 40 000 gamma/1 B12 -vitamint tartalmazó fermentlevet, adott esetben dúsítás után 95%-on felüli kitermeléssel dolgozhatjuk fel, mimellett a további műveletek (mint például extrakció, adszorpció, elució) könnyen és minimális veszteséggel hajthatók végre. A találmány tárgya eljárás B12 -vitamint és a fermentáció során képződött egyéb korrinvázas vegyületeket tartalmazó, adott esetben dúsított fermentlevek feltárására és sejtmentesítésére adott esetben cianidionok és vas(III)-klorid jelenlétében, azzal jellemezve, hogy az adott esetben dúsított fermentlevet 50—90 C°-on cianidionokkal és/vagy valamely ciánhidrinnel, előnyösen acetonciánhidrinnel 7,5—9,5, előnyösen 8,0—8,5 pH-értéken kezeljük, ezt követően a rendszerhez vas(III)-klorid vizes oldatát adjuk, majd az elegy pH-értékét valamely alkáliföldfémhidroxid és/vagy alkálifémhidroxid vizes szuszpenziójával, illetve oldatával, előnyösen kalciumhidroxid vizes szuszpenziójával, majd nátriumhidroxid vizes oldatával 7,5—8,5, előnyösen 7,8—8,2-re állítjuk, kívánt esetben a vas(III)-klorid és az alkáliföldfém- és/vagy alkálifém-hidroxid vizes oldatának, illetve szuszpenziójának adagolását részletekben végezzük, adott esetben ez utóbbi reaktánsok adagolási sorrendjét megcseréljük, végül a kapott, sejtfehérjéket és egyéb sejteredetű ballasztanyagokat tartalmazó koagulált vas(III)-hidroxid csapadékot elkülönítjük. A találmány szerinti eljárásban a kiindulási fermentlevet bármely bázissal lúgosíthatjuk. Bázisként alkalmazhatunk például ammóniumhidroxidot, nátriumhidroxidot, káliumhidroxidot, kalciumoxidot, kalciumhidroxidot, nátriumkarbonátot, káliumkarbonátot, vagy valamely szerves bázist, mint például alifás alkilamint, előnyösen azonban a legolcsóbb bázisok valamelyikét használjuk, mint például a nátriumhidroxidot, vagy kalciumhidroxidot. A bázist célszerűen vizes oldatban, vagy szuszpenzióban alkalmazzuk. Cianidion forrásként bármely a fermentleben cianidiont szolgáltató cianid-sót vagy egyéb CN-csoportot tartalmazó vegyületet alkalmazhatunk, előnyösen azonban nátrium- vagy káliumcianidot használunk. A találmány szerinti eljárásban alkalmazunk először a feltárásnál valamely ciánhidrint, erre vonatkozó irodalmi adat nincs. Bármely karbonil-vegyület, így bármely aldehid- vagy keton-ciánhidrinjét, mint például 5 acetonciánhidrint, benzaldehid-ciánhidrint, egyaránt jó eredménnyel használhatunk, célszerűen azonban a nagyiparilag gyártott, olcsó acetonciánhidrint alkalmazzuk. A ciánhidrint közvetlenül is hozzáadhatjuk a fermentléhez, de oldatban is alkalmazhatjuk amikor is 10 oldószerként célszerűen a fermentlével elegyedő oldószert használunk. A cianidionok és/vagy ciánhidrinek jelenlétében végzett kezelést (feltárás) 50—90 C°-on végezzük, előnyösen azonban 60—70 C°-on dolgozunk. Alacsonyabb 15 hőmérsékleten a kezelés ideje feleslegesen elhúzódik, valamint a feltárás hatásfoka is csökken; magasabb hőmérséklet viszont a feltárt sejtekből a fermentlébe kerülő koenzim nem kívánatos bomlását vonja maga után, aminek következtében a B12 -vitamin kitermelés 20 ugyancsak csökken. A cianidionokat szolgáltató cianid-sókat a fermentlé gyengén savas pH-tartományában is hozzáadhatjuk a fermentléhez, célszerűen azonban először a fermentlét 25 enyhén meglúgosítjuk és csak ezt követően adagoljuk a fermentléhez a cianidionokat szolgáltató cián-sókat. Ciánhidrinek, célszerűen acetonciánhidrin alkalmazása esetében először a fermentlevet gyengén meglúgosítjuk és csak ezt követően adagoljuk a ciánhidrint, vagy az 30 enyhén lúgos oldatát. Amennyiben a fentiekben leírt reakcióparamétereket, valamint az egyes reagensek adagolási sorrendjét betartjuk, a gyakorlatilag teljes feltárás elérésére elegendő a cianidionos és/vagy ciánhidrines kezelést 15—60 per-35 cig, célszerűen 20—40 percig végezni. A cianidionos és/vagy ciánhidrines kezelést (feltárás) követően a feltárt fermentléhez vizes vas(III)-klorid oldatot adunk. A vas (III)-klorid mennyiségét a fermentlé minősége, a fermentációhoz alkalmazott baktérium-40 fajták szabják meg. Általában 10—100 g, célszerűen 20—70 g FeCl3 . 6H 2 0-t adunk 1 1 fermentléhez, illetve a fermentlé sűrítményéhez és előnyösen a vas(IIl)-kloridos kezelést a feltárás hőmérsékletén 15—30 percig végezzük. Ez az idő elegendő a feltárt sejtek, valamint 45 a feltárt sejtekből a fermentlébe jutó kolloidális szennyezések koaguláltatásához. A koaguláltatás azonban önmagában nem elegendő ahhoz, hogy jól szűrhető fermentlevet kapjunk, különösen nem elégséges ahhoz, hogy olyan sejtmentesített 50 B12 -vitamin fermentlé szüredéket állítsunk elő, amely a szűrést követő további feldolgozáshoz is megfelelő tisztaságú. Tükrösen tiszta, kolloidális szennyeződésektől mentes, adszorpciós módszerrel könnyen feldolgozható és jól extrahálható fermentlevet csak abban az 55 esetben kapunk, ha a feltárt és vas(III)-klorid oldattal kezelt fermentlé pH-értékét a fentiekben ismertetett bázisok valamelyikével, előnyösen nátriumhidroxid, vagy kalciumhidroxid vizes oldatával vagy szuszpenziójával 50—90 C°-on, előnyösen 60—70 C°-on 7,8—8,2-re 60 állítjuk be és mintegy 10 percig ezen a hőmérsékleten tartjuk. Szakaszos, nagyüzemben végzett vas(III)-hidroxid képzésnél előnyösen oly módon járunk el, hogy a vas(Ill)-kloridot és a pH-érték beállításához szükséges 65 bázist kisebb részletekben váltakozva, mindaddig ada-4
