171243. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új dotriakontapeptidamidok előállítására
17 171243 18 Az e) pont szerint előállított 1,56 g dodekapeptidet melegítéssel 80 ml metanolban oldjuk és a szokásos módon hidrogénezzük. A terméket az oldat szárazra párlásával mint amorf maradékot kapjuk. Olvadáspont: körülbelül 160 °C. DS: Rf (43C)=0,30; Rf(52A) = 0,21; Rj(70) = 0,56. g) Z—Asn—Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)— —Tyr(tBu)—Pro—Gin—Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)— —Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2 445 mg Z—Asn—Lys(Boc)—Phe—His—NHNH2-t [Helv. 53, 2135 (1970)] melegítés közben 4 ml dimetil-formamidban oldunk, melyhez egymás után — 20 °C-on 350 [Jil 3,2 n sósavas dioxánt és 83 [xl terc-butil-nitritet adunk. A reakcióelegyet 15 percig —10 °C hőmérsékleten keverjük, majd az elegyhez 5 ml dimetil-formamidban oldva, az előbbi eljárás szerint előállított, 400 mg dodekapeptidet, valamint 192 [xl etil-diizopropil-amint adunk és 2 óra hosszat 0 °C hőmérsékleten keverjük. A reakcióhoz ezután ismét 48 jxl etil-diizopropil-amint adunk és egy éjjelen át 0 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A nyers terméket a reakcióelegy 100 ml éterbe történő csepegtetésével kicsapjuk és Craig-extrakcióval metanol, puffer, kloroform, szén-tetraklorid 10:3:7:4 rendszerben (puffer az 1. példa k) eljárásában megadott) egyenként 3 ml fázistérfogattal, több mint 650 szakaszban tisztítjuk. A 230—275 számú frakciókból szokásos módon a tiszta hexadekapeptidet, mint amorf port különítjük el (rmax = 255; K = 0,65). DS: Rf(43C) = 0,37; Rf(52A) = 0,27; Rj<70) = 0,63 h) H—Asn—Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)— —Tyr(tBu)—Pro—Gin—Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2—acetát A g) eljárás szerint előállított 250 mg hexadekapeptidet 30 ml 80%-os ecetsavban szokásos módon hidrogénezünk. A katalizátor leszűrése után a szűrletet körülbelül 4 ml-re betöményítjük és liofilizáljuk. DS: Rf(43C) = 0,24; Rj(52)=0,14; Rf (96)=0,34 i) Z—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)—Gin— —Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)—Phe—His— —Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Pro—Gin—Thr(tBu)—Asn— —Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2 274" mg Z—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe—NHNH2-t melegítés közben 2 ml dimetil-formamidban oldunk, melyhez —20 °C hőmérsékleten, egymás után 154 fxl 3,2 n sósav-oldatot (dioxánban) és 37 \ú terc-butil-nitritet adunk. A reakcióelegyhez 15 perc keverés után —10 °C hőmérsékleten az előbbi eljárás szerint előállított 275 mg hexadekapeptid-acetát és 2 ml dimetil-formamid 0 °C-ra lehűtött oldatát, valamint 85 \ú etil-diizopropil-amint adunk és 2 óra hosszat 0 °C hőmérsékleten keverjük. További 21 \ú etil-diizopropil-amint adunk a reakcióelegyhez, az elegyet 15 óra hosszat 0 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd a nyers terméket éter, petroléter (7:3) elegygyel mint porszerű csapadékot kicsapjuk. A terméket Craig-extrakcióval metanol, puffer, kloroform, szén-tetraklorid 10:3:5:5 rendszerben (puffer az 1. példa k) eljárásában megadott), egyenként 3 ml fázistérfogattal, több mint 345 szakaszban tisztítjuk. A 98—132 frakciókból (rmax =115; K = 0,5) a szokásos módon kromatográfiailag tiszta dokozapeptidet különítünk el. DS: Rf (43C) = 0,39; R f (52) = 0,29; Rf(96) = 0,48 5 j) H—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)—Phe—His—Thr(tBu)— —Tyr(tBu)—Pro—Gin—Thr(tBu)— —Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro— —NH2 10 A k) eljárás szerint előállított 173 mg dokozapeptidet 30 ml 80%-os ecetsavban 50 mg palládium-csontszénnel 15 óra hosszat hidrogénezünk, a szűrletet körülbelül 3—4 ml-re betöményítjük és liofilizáljuk. Az 15 ecetsav eltávolítására a liofilizátumot trifluor-etanol és nátrium-hidrogén-karbonát 5%-os oldatából kicsapjuk. DS: Rf(52) = 0,21; Rf (70)=0,63; Rf(100) = 0,17. 20 k) Bmp—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr(tBu)— —Cys—Val—Leu—Gly—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)— —Gin—Asp(OtBu)—Phe—Asn—Lys(Boc)—Phe— —His—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Pro—Gin—Thr(tBu)— 25 —Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2 A j) eljárás szerint előállított 127 mg dokozapepti-i det 65 mg Bmp—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr-30 1 (tBu)—Cys—Val—Leu—Gly—OH-t (2 050 434 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali irat), 12 mg N-hidroxi-szukcinimidet és 17,5 mg diciklohexil-karbodiimidet 0,5 ml dimetil-formamidban 35 oldunk, illetve szuszpendálunk és 3 1/2 óra hosszat 45 °C hőmérsékleten keverünk. A nyers terméket 50 ml éter hozzáadásával kicsapjuk és Craig-extrakcióval metanol, kloroform, szén-tetraklorid 10:3:5:4 rendszerben (puffer az 1. példa k) eljárásában megadott) több 40 mint 250 szakaszban egyenként 3 ml fázistérfogattal tisztítjuk. A 88—110 számú frakciókból (rmax = 100; K=0,67) szokásos módon kromatográfiailag egységes védett dotriakontapeptidet, mint amorf port kapjuk. DS: Rf (52) = 0,28; Rf(70) = 0,65; Rf(100)=0,27. 4. példa 50 | : 1 Bmp—Gly—Asn—Leu—Ser—Thr—Cys—Met— —Leu—Gly—Lys—Leu—Thr—Gin—Asp—Leu— —Asn—Lys—Leu—His—Thr—Tyr—Pro—Gin— —Thr—Asn—Thr—Gly—Val—Gly—Ala—Pro— 55 —NH 2—hidroklorid. (Dezamino—Cys1 —Lys 11 —Leu 12 -16 ' 19 —Tyr 22 — —Asn26 —Thr27—kalcitonin M hidroklorid) 60 50 mg Bmp—Gly—Asn—Leu—Ser(tBu)—Thr(tBu)— " i —Cys—Met—Leu—Gly—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)— —Gin—Asp(OtBu)—Leu—Asn—Lys(Boc)—Leu— —His—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Pro—Gin—Thr(tBu)— 65 —Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2-| 9
