171243. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új dotriakontapeptidamidok előállítására
19 171243 20 az 1. példában megadott eljárás szerint, 12 n sósav-oldattal 0 °C hőmérsékleten kezelve szabad peptiddé alakítunk. DC: Rf(45) = 0,47; Rf(101A) = 0,50; Rf(112E) = 0,42. Vékonyréteg-elektroforézis: pH 1,9; 16 volt/cm; 1 1/2 óra; futási távolság a kátédhoz körülbelül 3,7 cm. A védett dotriakontapeptidamidot például a következő módon állítjuk elő: a) H—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Leu— —OMe 3,6 g Z—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Leu— —OMe-t (2 050 434 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali irat) 90 ml metanolban 360 mg palládium-csontszénnel szén-dioxid-abszorpció közben telítésig hidrogénezünk. A katalizátort leszűrjük és a szűrletet szárazra pároljuk. DS: Rf(kloroform, metanol 9:1)=0,15; Rf(89) = 0,32. b) Z—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Leu—OMe 840 mg H—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)— —Leu—OMe-t 5 ml dimetil-formamidban oldunk, 765 mg Z—Lys(Boc)—ONp-t adunk hozzá és egy éjjelen át 22 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A reakcióelegyet ezután nagyvákuumban szirup sűrűségűre bepároljuk és a nyers terméket 30 ml éter hozzáadásával mint kocsonyás anyagot kicsapjuk. A tisztítást metanol, etil-acetát, petroléter elegyből történő kicsapással végezzük, így tiszta hexapeptid-származékot kapunk. Olvadáspont: 218—220 °C. "' DS: Rf(kloroform, metanol 9:1)=0,41; Rf(89) = 0,61. c) Z—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp-(OtBu)—Leu—NHNH2 Az előbbi b) eljárás szerint előállított 720 mg hexapeptid-metil-észtert 40 ml abszolút metanolban oldjuk és 3,6 ml hidrazin-hidrát hozzáadása után 5 óra hoszszat 22 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A képződött hexapeptid-hidrazidot 75 ml víz hozzáadásával kicsapjuk, szűrjük, vízzel jól kimossuk és szárítjuk. Olvadáspont: 215—218 °C. DS: Rf(kloroform, metanol 8:2)=0,55; Rf (89) = 0,29. d) Z—Asn—Lys(Boc)—Leu—His—Thr(tBu)— —Tyr(tBu)—Pro—Gly—Thr(tBu)—Asn—Thr-(tBu)— —Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2 636 mg Z—Asn—Lys(Boc)—Leu—His—NHNH2-t (2 050 434 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali irat) melegítés közben 10 ml dimetil-formamidban oldunk, —20 °C-ra lehűtjük és egymás után 525 [ú 3,2 n sósav-oldatot (dioxánban) és 119 |jt,l terc-butil-nitritet adunk hozzá. A reakcióelegyet 15 percig —15 °C hőmérsékleten keverjük, melyhez ezután 600 mg H—Thr(tBu)—Tyr(tBu)—Pro—Gin— —Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)—Gly—Val—Gly—Ala— —Pro—NH2 (a 3. példa f) eljárása szerint előállítva) és 4,5 ml dimetil-formamid 0 °C-ra lehűtött oldatát, valamint 230 \ú N-metil-morfólint adunk. A reakcióelegyet 2 óra hosszat 0 °C hőmérsékleten keverjük, újabb 46 [ú N-metil-morfolint adunk hozzá és egy.éjjelen át 0 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A nyers tör,-5 méket 100 ml éterrel kicsapjuk és Craig-extrakcióval acetonitril, puffer, kloroform, metanol 1:1:1:1 rendszerben (puffer az 1. példa k) eljárásában megadott) több mint 500 szakaszban egyenként 3 ml fázistérfogattal tisztítjuk. A tiszta hexadekapeptidet a 38—62 számú 10 frakciók (rmax = 50; K=0,11) szárazra történő bépárlásával és a puffer nagyvákuumban, 40 °C hőmérsékleten történő kiszublimálásával, mint amorf port kapjuk. DS: Rf(43C) = 0,38; Rf(52A)=0;28; Rj{70)=0,5L ) 15 e) H—Asn—Lys(Boc)—Leu—His—Thr(tBü)— —Tyr(tBu)—Pro—Gin—Thr(tBu)—Asn—Thr-(tBu)— —Gly—Val—Gly—Ala—Pro--NH2—acetaj Az előbbi d) eljárás szerint előállított 380 mg hexa-20 dekapeptidet 45 ml 85%-os ecetsavban 50 mg palládium-csontszénnel a kiindulási termék eltűnéséig (vékonyréteg-kromatográfiával ellenőrizve) hidrogénezünk. A katalizátor leszűrése után a szűrletet körülbelül 4 ml-re betöményítjük és liofilizáljuk. 25 08^430=0,29^70) = 0,40 /; Z—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Leu—Asn—Lys(Boc)—Leu—His—Thr(tBu)— —Tyr-(tBu)—Pro—Gin—Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu)— 30 Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2 230 mg Z—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Leu—NHNH2-t 2 ml dimetil-formamidban oldunk, melyhez —20 °C hőmérsékleten egymás után 35 134 [xl 2,3 n sósav-oldatot (dioxánban) és 32 ml terc-butil-nitritet adunk. Az oldatot 15 percig —10 °C hőmérsékleten keverjük, melyhez 3 ml dimetil-formamidban oldott 306 mg e) pont szerint előállított hexadekapeptid-acetátot és 63 \ú N-metil-morfolint adunk. A re-40 akcióelegyet 0 °C hőmérsékleten 2 óra hosszat tovább keverjük, ismét 15 fjtl N-metil-morfblint adunk hozzá, egy éjjelen át 0 C C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd a nyers terméket 60 ml éter és 30 ml petroléter hozzáadásával kicsapjuk. A tisztítást Craig-extrakcióval több 45 mint 240 szakaszban, metanol, puffer, kloroform, szén-tetraklorid 10:3:5:5 rendszerben (puffer az 1. példa k) eljárásában megadott) végezzük. A 83—107 számú frakciókból (rmax = 95; K=0,65) szokásos módon a tiszta dokozapeptidet, mint amorf port különítjük el. 50 DS:Rf (52)=0,27;R f (70) = 0,59;R f (100)=0,41 g) H—Lys(Boc)—Leu—Thr(tBu)—Gin—Asp(OtBu)—Leu—Asn—Lys(Boc)—Leu—His—Thr(tBu)— —Tyr(tBu)—Pro—Gin—Thr(tBu)—Asn—Thr(tBu>— 55 —Gly—Val—Gly—Ala—Pro—NH2 -Azf) eljárás szerint előállított 100 mg dokozapeptidet 16 ml 80%-os ecetsavban 15 mg palládium-csontszénnel egy éjjelen át hidrogénezünk. A katalizátort 60 ezután leszűrjük, a szűrletet körülbelül 2 ml-re betöményítjük és liofilizáljuk. Az ecetsav eltávolítására a maradékot 0,6 ml trifluór-etanolban oldjuk, majd 5 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldatra csepegtetve ismét kicsapjuk. 65 DS: Rf(52)=0,18; Rf(70) = 0,50; Rf (100)=0,20 10
