171233. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikus hatású figaroesav komplex előállítására

171233 7 8 A C—31,751 jelzésű törzs a sejtfalban mezo-diaminopimelinsavat (mezo-D AP) tartalmaz jellegzetes aminosav-komponensként. Nincs jelen diagnosztikai szénhidrát. Összefoglalva a fenti jellemzőket megállapíthatjuk, hogy a C—31,751 jelzésű törzs rózsaszín (halványrózsaszín) légmicéliumot és gömbalakú sporangiumot képez. A sporangiumhordozó nem mozgékony. A sporangiumhordozó rövid, hossza általában 10 \i alatti. A szubsztrát micélium tömegének színe narancs- és ibolyaszín közötti. Jól látható, diffundálásra képes színezék (beleértve a melanint) nem képződik. A növekedéshez csaknem az összes szokásos szénhidrátot hasznosítja. A törzs sejtfala mezo-diaminopimelinsavat tartalmaz, azonban nem tartalmaz diagnosztikai cukorkomponenst. Ezek a fő jellemzők azt jelzik, hogy a C—31,751 jelzésű törzs a Streptosporangium genushoz tartozik. Nonomura H. és Ohara Y. a Streptosporangium fajok taxonómiai osztályozásában [J. Ferment. Technol. 47 (11): 701—709. (1969.) és 52 (2): 71—77. (1974.)] 16 fajt ír le. Ezek közül 8 fajnak van rózsaszínes légmicéliuma és rövid sporangiumhordozója; ezek az alábbiak: Streptosporangium rubrum, Potekina 1965., S. longisporum, Schaffer 1969., S. roseum, Couch 1955., S. amethystogenes, Nonomura és Ohara I960., S. amethystogenes var. nonreducens, Prauser és Eckerdt 1967., S. vulgare, Nonomura és Ohara I960., S. pseudovulgare, Nonomura és Ohara 1969. és S. nondiastaticum, Nonomura és Ohara 1969. Ezután adták hozzá ugyanehhez a faj-csoporthoz a S. violaceochromogenes MK—49-et (49—42896 számú japán szabadalmi leírás). A C—31,751 jelzésű törzs abban tér el a Streptosporangium amethystogenes, S. roseum és S. vulgare fajtörzsétől, hogy 42 °C-on növekszik, a S. longisporum fajtörzseitől, hogy spórája gömbalakú, a S. nondiastaticum faj törzseitől, hogy hasznosítja a ramnózt, inozitot és a keményítőt, a S. pseudovulgare faj törzseitől pedig abban, hogy hasznosítja a ramnózt és ionizitot és szubsztrát micéliuma narancs vagy vöröses bíbor színű. A S. violaceochromogenes faj törzsei abban különböznek a C—31,751 jelzésű törzstől, hogy szubsztrát micéliumuk színtelen vagy aranyszínű, és az inozitot és ramnózt nem hasznosítja vagy kétséges ezek hasznosítása. A C—31,751 jelzésű törzs számos jellemzője megegyezik a Potekina L. L. által leírt Streptosporangium rubrum törzs jellemzőivel [Mikrobiologija, 34, 292. (1962)], így a légmicélium tömegének színe, a szubsztrát micélium színe, az oldható színezék és a spóraalak. A S. rubrum jelenleg elérhető leírása azonban nem elegendő ahhoz, hogy határozott következtetést vonjunk le a két mikroorganizmus azonosságára vonatkozóan, ezért addig, amíg további adatok nem lesznek elérhetők, a C—31,751 jelzésű törzset a Streptosporangium meg nem határozott fajához tartozónak tekintjük. A találmány szerinti eljárásban elvileg minden olyan figaroesavat termelő Streptosporangium törzs alkalmazható, amely az ATCC 31129 szám alatt letétbe helyezett törzs jellemzőit mutatja, beleértve a mikroorganiz mus olyan mutánsait is, amelyek figaroesav-komplexet termelnek. Ezeket a mutánsokat különböző módokon állíthatjuk elő, így röntgen- vagy ultraibolya-besugárzással, mustárnitrogénnel, aktinofágokkal és hasonlókkal. A figaroesav-komplexet a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy a figaroesav-komplexet termelő Streptosporangium ATCC 31129 törzs szubmerz, levegőztetett körülmények között tenyésztjük vizes táptalajban. 5 A mikroorganizmust asszimilálható szénforrást, például asszimilálható szénhidrátot tartalmazó táptalajon tenyésztjük. Előnyösen alkalmazható szénforrás például a laktóz, glicerin, szacharóz, gabonakeményítő, glükóz, mannóz és fruktóz. Ha a táptalajban szénforrásként 10 keményítőt alkalmazunk, kinyerés előtt amilázt adhatunk a táptalajhoz, hogy elkerüljük az esetleges emulzióképződést. A táptalajnak asszimilálható nitrogénforrást is kell tartalmaznia, így például hallisztet, peptont, szójabablisztet, földimogyorólisztet, gyapotmag-15 lisztet és kukoricalekvárt. A táptalajhoz szervetlen tápsókat is adhatunk; ezek a sók nátrium-, kálum-, ammónium-, kalcium-, foszfát-, szulfát-, klorid-, bromid-, nitrát-, karbonát- és hasonló ionokat szolgáltató szokásos sók lehetnek. 20 A figaroesav-komplex előállítását bármely olyan hőmérsékleten végezhetjük, amely elősegíti a mikroorganizmus megfelelő növekedését, azaz szobahőmérséklet és körülbelül 43 °C közötti hőmérsékleten; az eljárást előnyösen valósíthatjuk meg 27 °C körüli hőmérsékle-25 ten. Optimális hozamot általában körülbelül 170—210 óra inkubálási idő után érünk el. A közeg általában gyengén lúgos, a pontos pH-érték azonban az alkalmazott közegtől függően változhat. A fermentációt megvalósíthatjuk Erlenmeyer lombikokban és különböző 30 térfogatú laboratóriumi vagy ipari méretű fermentorokban. Ha az eljárást ipari méretű fermentorban valósítjuk meg, előnyös, ha vegetatív inokulumot állítunk elő a táptalajban oly módon, hogy a táptalajt a mikroorganizmus ferde agar kultúrájával vagy talaj kultúrájával 35 vagy pedig liofilizált kultúrájával inokuláljuk. Miután ily módon aktív inokulumot kaptunk, ezt aszeptikusán átvisszük az antibiotikum komplex nagyüzemi előállítására szolgáló fermentorba. A közeg, amelyben a vegetatív inokulumot előállítjuk, azonos lehet azzal a kö-40 zeggel, amelyet a fermentorban alkalmazunk az új komplex előállítására, amennyiben az olyan, hogy a mikroorganizmus jól növekszik rajta, vagy attól eltérő is lehet. Amikor a fermentáció befejeződött, az antibiotikum 45 komplexet valamely alkalmas, vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel végzett extrakcióval kinyerjük a táptalajból, a szerves extraktumot betöményítjük, és a komplexet a betöményített extraktum valamely alkalmas antiszolvenssel végzett hígításával szilárd alakban 50 kicsapjuk. Az extrahálást vízzel nem elegyedő szerves oldószerekkel végezhetjük, amelyeknek polaritása a metilénklorid és az n-butanol polaritása között változhat, körülbelül 3,5 és 8,5 közötti pH-tartományban. A közbeeső polaritás-tartományba eső oldószerek, így 55 a ketonok és észterek az előnyösek, minthogy úgy találtuk, hogy azok szelektívebbek, mint az alkoholok, viszont elég polárisak ahhoz, hogy jó megosztást érjünk el. A különösen előnyös extraháló oldószerek példái a metil-izobutil-keton és az etilacetát. A legelőnyö-60 sebb oldószer a metil-izobutil-keton. Az extrakciót kényelmesen valósíthatjuk meg gyengén savas körülmények között, azaz a 4,0—5,0 pH-tartományban valamely ásványi sav, így sósav vagy kénsav hozzáadásával vagy pedig gyengén lúgos körülmények között, azaz 65 8,0—8,5 pH-tartományban. Maximális hozamot akkor 4