171139. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kölcsönös specifikus kötésre hajlamos anyagok kvantitatív meghatározására
13 171139 14 és Freund-féle komplett adalékanyag 50 :50 arányú homogén keveréke. Az állatok mindegyik talpába a homogenizált keverékből 0,25 ml-t injektálunk. E kezelés után 21, 23, 56 és 58 nappal az állatokba négy helyen (két helyen elöl és két helyen hátul) szubkután 0,25 ml serkentő oltóanyagot injektálunk. A serkentő oltóanyag azonos térfogatban 8 mg/ml koncentrációjú kristályos sertésinzulin-cinksó-oldatot és Freund-féle inkomplett adalékanyagot tartalmaz. 68 nap elteltével az állatoktól vért veszünk és egy végsó serkentő oltóanyagot adunk be, amennyiben a titer közel nulla (az első kezelést követő közel 70. napon), A végső serkentő oltóanyag beadása után 10 nappal az állatokat elvéreztetjük. b) A kísérleti eszköz elkészítése Brómciánnal aktivált Sepharose 4B márkanevű gélt (gyártó cége: Pharmacia AB, Uppsala, Svédország) 15 percen át 0,001 mólos sósavban duzzasztunk, majd szintereit üvegszűrőn 0,001 mólos sósavval mossuk. A brómciánnal aktivált Sepharose 4B gélhez ezután hozzákapcsoljuk az a) lépésben kapott frakcionálatlan antiszérum teljes mennyiségét úgy, hogy a teljes mennyiségű frakcionálatlan antiszérumot összekeverjük a Sepharose térfogatával azonos térfogatú 0,2 mólos citrátpufferrel (pH-ja: 6,5), majd az így kapott elegyet a duzzasztott Sepharose-hoz hozzáadjuk. A kapott keveréket egy éjszakán át 4 C°-on keverjük. Az antitesttel kapcsolt Sepharose-szuszpenziót ezután addig mossuk 0,2 mólos, 6,5 pH-jú citrátpufferrel, míg a mosó folyadék optikai sűrűsége 280 nm-nél 0,05-nél kisebb és ezután 0,9%-os fiziológiás konyhasóoldattal, míg a mosófolyadék optikai sűrűsége 215 nm-nél 0,05-nél kisebb lesz. Az antitesttel kapcsolt Sepharose-t ezután addig a pontig hígítjuk tiszta (antitesttel nem kapcsolt) Sepharose-zal, míg a radiaktive jelzett inzulin mennyiségének 30-50%-a az alábbi c) lépésben ismertetett, inzulint nem tartalmazó folyadékmintát vizsgáló módszert követve az oszlopban visszamarad. A Sepharose-keveréket ezután 0,1% nátrium-azidot tartalmazó 0,9%-os fiziológiás konyhasóoldattal feliszapoljuk és 3 ml térfogatú, polietilénből készült tartókorongokkal felszerelt Stylex műanyagfecskendőkbe (alakja és szerkezete hasonló az 1/1 rajzlapon megadott ábrán látható eszközhöz, gyártó cége a Pharmaseal Laboratories, Glendale, kaliforniai cég) töltjük, amikor is 1 ml Sepharose-zal töltött oszlopokat kapunk. c) A meghatározás A töltött oszlopok kiegyensúlyozását úgy végezzük, hogy 20 ml-es adagokban 9,0 pH-jú borátpuffert adunk az oszlopokhoz és hagyjuk őket megszáradni. A borátpuffert úgy készítjük, hogy kálium-kloridra és bórsavra nézve egyaránt 0,1 mólos vizes oldatból 50 ml-t, valamint 20,8 ml 0,1 mólos nátrium-hidroxid-oldatot, 1,7 ml 30%-os humán szérum-albumint és 27,5 ml vizet elegyítünk. Sertésinzulin-standardokat készítünk 50 ß egység/ml, 100M egység/ml és 250 ß egység/ml koncentrációkkal. A fenti b) lépésben kapott oszlopokhoz ezután inzulint nem tartalmazó kontrollmintát és a három inzulin-standardot 5 hozzáadjuk 0,5-0,5 ml mennyiségekben 25 perces kontaktidőket biztosítva. 125 I izotóppal jelzett inzulint tartalmazó jelzett mintát adunk ezután minden egyes oszlophoz 0,5—0,5 ml mennyiségben 25 perces kontaktidőt biztosítva. Ez alatt az idő 10 alatt az oszlopok radiaktivitását Gammacord típusú gammasugárzásszámlálóval [gyártó cége a Miles Laboratories, Inc., elkhart-i (Indiana állam), amerikai egyesült államokbeli cég] észleljük. Az oszlopokat ezután 10 ml borátpufferrel mossuk és 15 radiaktivitásukat újra megmérjük. Az eredmények az alábbiak (százalékos kötöttségben kifejezve, amelyet annak alapján számolunk, hogy a kontrollminta százalékos kötöttségét 100 százaléknak vesszük): Inzulin-koncentráció Százalékos JU egység/ml kötöttség 0 100 25 66 50 43 100 28 250 17 Ezek az adatok azután grafikusan ábrázolhatók, 35 amikor is egy kalibrálógörbét kapunk, amellyel ismeretlen mennyiségű inzulint tartalmazó minták meghatározhatók úgy, hogy a százalékos kötött jelzett inzulint e görbéhez hasonlítjuk. 2. példa Ebben a példában olyan módszert és eszközt ismertetünk, amellyel egy dózisválasz-görbét (kalib-45 rálógörbét) kapunk Bi2 vitamin meghatározásához, egyensúlyi módszert alkalmazva. a) A kísérleti eszköz elkészítése 50 Intrinsic factor (17) nevű anyagot (szállító cége a Nutritional Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio állam, Amerikai Egyesült Államok), vagyis egy, Bi2 vitamint megkötő anyagot brómciánnal aktivált Sepharose 4B gélhez (gyártó cége 55 Pharmacia AB, Uppsala, Svédország) kapcsolunk kovalensen a Scand. J. Clin. Lab. Invest., 27, 151 (1971) irodalmi helyen ismertetett módszerrel. Az intrinsic factor (17) anyaggal kapcsolt Sepharose 4B gélt ezután tiszta (nem kapcsolt) Sepharose 4B 60 géllel hígítjuk addig a pontig, ahol az oszlopban a b) lépésben ismertetett, B12 vitamint nem tartalmazó folyadékmintát vizsgáló módszert követve a radioaktive jelzett Bi2 vitamin 40-60%-a visszamarad. E célra radioaktív BJ2 vitamint (S7 Co 65 cianocobalanin, gyártó cége Amersham-Searle, 7
