171139. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kölcsönös specifikus kötésre hajlamos anyagok kvantitatív meghatározására
15 171139 16 Arlington Heights, Illinois állam, Amerikai Egyesült Államok) használunk. A keveréket ezután 0,9%-os fiziológiás konyhasóoldattal feliszapoljuk és 3 ml-es műanyag fecskendőkbe töltjük, amikor is az 1. példa b) lépéséhez hasonlóan lml Sepharose-zal 5 töltött oszlopokat kapunk. b) A meghatározás 10 2000pg/ml, 1000pg/ml, 500pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 63 pg/ml és 31 pg/ml koncentrációjú standard Bi2 vitamin-oldatokat készítünk. B J2 vitamint nem tartalmazó kontrolloldatot és a hét, B12 vitamint tartalmazó standardot egyenként 15 elegyítjük 0,5 ml, radioaktive jelzett Bj 2 vitamint tartalmazó oldattal, amikor is l-l ml térfogatú oldatokat kapunk. Ezeket az oldatokat felvisszük az a) lépésben ismertetett módon előállított oszlopokra 90 perces kontaktidőt biztosítva. Az oszló- 20 pokat ezután 6—6 ml pufferrel [előállítását lásd: Scand. J. Clin. Lab. Invest., 27, 151 (1971)] mossuk, majd radioaktivitásukat Gammacord típusú gammasugárzásszámlálóval mérjük. Az alábbi eredményeket kapjuk (százalékos kötöttségben ki- 25 fejezve, amelyet annak alapján számolunk, hogy a kontrollminta százalékos kötöttségét 100 százaléknak vesszük): Bi2 vitamin Százalékos koncentrációja kötöttség pg/ml 0 100,0 31 94,9 63 87,8 125 79,8 250 65,6 500 44,7 1000 24,2 2000 13,6 Ismeretlen mennyiségű Bi2 vitamint tartalmazó minták ezután a fenti eredmények ábrázolása útján kapott kalibráló görbéből meghatározhatók, mint ezt az 1. példa c) lépésében leírtuk. 55 3. példa Ebben a példában olyan eszközt és módszert 60 ismertetünk, amellyel egy dózisválasz-görbét (kalibrálógörbét) kapunk emberi méhlepényi laktogén (HPL - human placental lactogen) meghatározásához, ahol a jelzett HPL egy enzimmel jelzett formában van. 65 a) Az enzimmel jelzett HPL elkészítése HPL-t peroxidázzal jelzünk az Immunochemistry, 6, 43 (1969) irodalmi helyen ismertetett módon az alábbi módosításokkal: 10 mg HPL-t és 10 mg, tormából izolált peroxidázt feloldunk 1,4 ml 0,05 mólos, 9 pH-jú karbonátpufferben, majd a kapott elegyhez 0,05 ml 3%-os glutáraldehid-oldatot adunk. A kapott elegyet ezután a környezet hőmérsékletén 90 percen át forgatjuk, majd 128 ml 0,1 mólos és 8pH-jú borátpufferrel szemben a puffert többször cserélve dializáljuk. b) A kísérleti eszköz készítése Az 1. példa b) lépésében ismertetett módszert követjük. c) A meghatározás A töltött oszlopokat kiegyensúlyozzuk az 1. példa c) lépésében ismertetett, 9pH-jú borátpufferből 20-20 ml-t az oszlopokba töltve, majd az oszlopokat megszáradni hagyva. Ezután 1000 ng/ml és 62 ng/ml koncentrációjú HPL-standardokat készítünk. Ezt követően az oszlopokra felvisszük a két HPL-standardot és egy, HPL-t nem tartalmazó kontrollmintát 0,5-0,5 ml mennyiségben 25 perces kontaktidőt biztosítva. Az a) lépésben kapott jelzett HPL-mintából minden egyes oszlophoz ezután 0,55-0,5 ml-t adunk szintén 25 perces kontaktidőt biztosítva. Az oszlopokat ezt követően először 10 ml 0,1 mólos és 8pH-jú borátpufferrel, majd 3 ml 0,1 mólos és 6 pH-jú foszfátpufferrel mossuk. Ezután elkészítünk egy szubsztrát-indikátor oldatot 0,28 ml 0,03%-os vizes hidrogénperoxid-oldat, 0,1 ml 0,25%-os 3,3'-dimetil-benzidin-oldat és 0,12 ml 0,1 mólos és 6pH-jú foszfátpuffer elegyítése útján, majd az így kapott oldatot minden egyes oszlophoz hozzáadjuk (vagyis annyi indikátoroldatot készítünk, ahány oszlopot használunk) 10 perces kontaktidő biztosítása mellett. Végül minden egyes oszlopot 0,1 n sósavból 3—3 ml-rel mosunk, majd a mosófolyadékok optikai sűrűségét (OD) 460nm-nél mérjük. Az alábbi eredményeket kapjuk: HPL-koncentráció CD4 6 0 Százalékos ng/ml színmegkötés 0 1,2 100 62 0,96 63 1000 0,78 35 Ismeretlen koncentrációjú minták az 1. példa c) lépésében ismertetett módon a fenti értékekből kapott kalibrálógörbe segítségével meghatározhatók. 4. példa Ebben a példában olyan módszert és eszközt ismertetünk, amellyel hepatitisz B antigén határoz-
