171139. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kölcsönös specifikus kötésre hajlamos anyagok kvantitatív meghatározására
11 171139 12 Ahol a szilárd fázis olyan, hogy nem rendelkezik a kívánt folyadékvisszatartó képességgel, és ahol a folyékony fázisra a gravitációnál nagyobb erő hat, vagy ahol a folyékony minták térfogata nagy, ott az oszlop vagy test kiömlő nyílását előnyösen szelektív módon lezárhatóvá tesszük valamilyen szelep vagy sapka alkalmazásával. Az oszlop szelektíven lezárható nyitott végét tehát vagy nyitva tarthatjuk, részben lezárhatjuk vagy teljesen lezárhatjuk. A részben lezárt állapotot választhatjuk abban az esetben, ha az átfolyási sebességet csökkenteni és ezáltal a szilárd fázis és a folyékony fázisok közötti kontaktidőt növelni akarjuk, míg a teljesen zárt állapotot abban az esetben választjuk, ha a szilárd fázis és a folyékony fázis között hosszabb kontaktidőt akarunk biztosítani. Minden egyes esetben a kontaktidő néhány perc és néhány nap között változhat, előnyösen 15 perc és 12 óra között van. Ez a kontaktidő ahhoz szükséges, hogy a lehetőség szerint messzemenően biztosítsuk a kvantitatív reakciót a meghatározandó anyag és a jelzett komponens között az eszközben a folyékony fázisok egymást követő átfolyása során. A találmány szerinti eljárással és eszközzel bármely specifikus kötésre hajlamos anyag kvantitatíve meghatározható. Specifikus kötésre hajlamos partnereik hasznosításával a találmány szerinti eljárás és eszköz tehát lehetővé teszi bármely specifikus kötésre hajlamos anyag kimutatását. Ilyen anyagok közé tartozik közelebbről az inzulin, proinzulin, növekedési hormon, angiotensin I és II, humán méhlepényi laktogén, humán korionbeli gonadotropin, luteinizáló hormon, pajzsmirigyet stimuláló hormon, paráthormon, progeszteron, aldoszteron, koleszterin, follikuluszt stimuláló hormon, tesztoszteron, vitamin D csoport, eritropoietin, alfa-1-antitripszin, renin és morfin. Más meghatározható anyagok közé tartoznak a kortikoidok, lizotropin, vazopresszin, Oxitocin, relaxin, gasztrin, bradikinin, kalcitonin, plazmin, glükagon, vitamin B csoport, ösztrogénnek, digoxin, digitoxin, ausztráliai antigén és a tetanusz-toxin. A referenciamintában a jelzett komponens lehet rádióaktív jelzett komponens vagy pedig egy úgynevezett enzim-szubsztrát jelzett komponens. Az enzim-szubsztrát jelzett rendszerben a jelzendő anyag kémiailag kötve vagy kapcsolva van egy enzimhez vagy annak szubsztrátjához olyan hagyományos módszerekkel, amelyek alkalmazása esetében elkerülhető az enzimszerűen aktív molekularészek lényeges inhibitálása. Bizonyos anyagok közvetlenül reagáltathatok egy enzimmel vagy annak szubsztrátjával jelzett komponenst képezve, míg más- anyagok esetében szükséges kémiai kapcsoló reagensek, így például karbodiimidek, diizocianátok, glutáraldehid, vagy bisz-diazobenzidin alkalmazása. Az oszlop által visszatartott jelzett komponens mennyisége meghatározható az eluátumban vagy magában az oszlopban végzett enzimmeghatározás útján. Az enzimmeghatározás végezhető kolorimetriás, spektrofotometriás vagy fluorimetriás módszerekkel. Alkalmazhatunk ugyanakkor bármely ismert módszert felhasználva radioaktív jelzéses technikát is. Radiaktív jelzéses technika alkalmazása esetében az alkalmazható jelzett izotópok közé tartozik a 5 12S I (jód 125-ös izotópja), 131 I (jód 131-es izotópja), 14 C (szén 14-es izotópja) és a 3 H (trícium). Előnyösen a 12S I izotópot használjuk, tekintettel arra, hogy a jódozás általában kivitelezhető jelzési módszer és a '3 ' I izotóp felezési ideje l° viszonylag rövidebb. A radioaktív jelzés végezhető a jelzendő komponens közvetlen jelzése útján vagy pedig úgy, hogy egy második anyagot jelzünk, mely aztán a jelzendő anyaggal konjugátumot képez anélkül, hogy annak specifikus kötésre való I5 hajlamát csökkentené. Ha az oszlop meghatározott geometriájú, akkor az oszlop által visszatartott jelzett komponens mennyisége mérhető az oszlopból sugárzó radioaktivitás mérése és standardokkal való összehasonlítása útján. Alternatív módon 20 mérhetjük az eluátum radiaktivitását és összehasonlíthatjuk standard értékekkel. Általában a jelzett komponenst úgy érintkeztetjük a mátrixszal, hogy egy folyadékban, például a szilárd fázishoz kötött meghatározandó anyaggal szemben kémiailag 25 közömbös pufferben oldva a mátrixon átbocsátjuk. A találmány szerinti eljárással meghatározható folyadékminták közé tartoznak a specifikus kötésre hajlamos anyagok szervetlen és szerves oldatai. A^ folyadékminta térfogata elméletileg érdektelen, 30 tekintettel arra, hogy a találmány szerinti eszköz átfolyásos típusú. Egy konkrét alkalmazás esetében azonban igen híg, specifikus kötésre hajlamos anyagot tartalmazó folyadékminták is meghatározhatók a találmány szerinti eljárással 35 nagyobb térfogatú minták átbocsátása útján, minthogy az oszlop koncentráló és elkülönítő eszközként is hat. Rendkívül figyelemreméltó, hogy a szilárd fázis - folyadékfázis kölcsönhatásban a specifikus kötésre hajlamos anyag és partnere 40 közötti reakció arányának koncentrációfüggésére tekintettel megnövelt hatásos koncentráció érhető el, miáltal a kontaktidő csökkenthető és a mérés pontossága megnövelhető. A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi specifikus kötésre hajlamos 45 anyagok meghatározását testnedvekben és szövetextraktumokban. Ilyen testnedvek közé tartoznak az amniotikus folyadékok, agyi és gerincvelői folyadékok, vérszérum, vérplazma és a vizelet. A találmányt közelebbről az alábbi példákkal 50 kívánjuk megvilágítani. 1. példa 55 Ebben a példában olyan módszert és eszközt ismertetünk, amellyel egy dózisválasz-görbét (kalibrálógörbét) kapunk inzulin meghatározásához, telítéses módszert alkalmazva. 60 a) Inzulin-antitestek kiváltása Délamerikai vízidisznóknak egy első oltóanyagot injektálunk, amely 8 mg/ml koncentrációjú kristályos sertésinzulin-cinksó-oldat (0,01 n sósavban 65 oldva és 0,01 n nátrium-hidroxiddal semlegesítve) 6
