171026. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikum-keverék előállítására
13 171026 14 enzimatikusan hidrolizált kazein 0,5% kobaltklorid 0,0002% pH 7,0 5 A fermentációt 20 óra és 30 óra közötti időn át 28 C° és 36 C° közötti hőmérsékleten végezzük, miközben percenként 1700-at forduló keverőt működtetünk, és percenként a táptalaj térfogatával 10 azonos mennyiségű levegőt vezetünk át a tenyészeten. Ha szükséges, 7-re állítjuk be a tenyészlé pH-ját, majd kétszer 1/3-1/2 térfogat metil-izobutil-ketonnal extraháljuk. Csökkentett nyomáson desztilláljuk az 15 oldószeres extraktumot, a desztillációs maradékot petroléteres extrakcióval zsírmentesítjük. A tenyészlé, az oldószeres extraktumok és a következőkben kapott frakciók antibiotikum-tartalmát szilikagél vékonyrétegkromatográfiával, az eluálást kloroform 20 és etanol 9 : 1 arányú elegyével végezve ellenőrizzük, az előhívást 254 és 366 nyj hullámhosszúságú ultraibolya fényben végezzük. A zsírmentes oldószeres sűrítményt csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A szilárd halmazállapotú 25 terméket 6 fázisú Craig-f. ellenáramú megoszlásnak vetjük alá, oldószerelegyként a következő elegyet használjuk: toluol 5 rész, etanol 2 rész, vizes pH 4,5 foszfát puffer 3 rész. Az elkülönült rétegek adják a megoszlásos-rendszer felső és alsó fázisát. A megosz- 30 lást követően vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk a rétegeket. A 37 277 jelű depszipeptid a felső rétegben, elsősorban a 0 helyen koncetrálódik. A második, 37 932 jelű depszipeptid az 1, 2 és 3 felső rétegekben 35 található. A 35 763 jelű makrociklusos lakton elsősorban a 0 és 1 alsó rétegekben jelenik meg. A 36 926 jelű vegyület a 2, 3, 4 és 5 alsó fázisokban koncentrálódik. Az 0 felső fázist, amely a 37 277 jelű vegyületet 40 tartalmazza csökkentett nyomáson desztilláljuk, a száraz desztillációs maradékot kloroformban oldjuk, és 30 percen át aktív szénnel keverjük. Szűrjük a szuszpenziót, a szűrletet csökkentett nyomáson desztilláljuk. Acetonban oldjuk a desztillációs mára- 45 dékot, heptán adagolására csapadék válik ki az oldatból. A kivált csapadékot kevés kloroformban oldjuk, és kloroform és n-propanol 99 :1 arányú 6 pH-ra pufferezett elegyével készült szilikagél oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást 5,44 atü nyomáson 50 hasonló eleggyel végezzük. Az eluátumokat vékonyrétegkromatográfiával vizsgáljuk. Az elkülönített 37 277 jelű vegyületet tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékként kapott terméket pedig aceton és 55 heptán elegyéből kikristályosítjuk. A 37 277 jelű vegyületnek nincs jól meghatározható olvadáspontja. 140 C° és 150C° közötti hőmérsékleten bomlás következik be. Dietil-éterben, 60 hexánban, heptánban és vízben oldhatatlan. Acetonban és benzolban gyengén, metanolban, etanolban, kloroformban és metilénkloridban jól oldódik. A 37 277 jelű vegyület elemösszetétele a következő: 65 szén 60,9 i% hidrogén 5,98% nitrogén 10,45% oxigén (a különbségből) 22,66% A 37 277 jelű vegyület optikailag aktív, forgatása [a]£,s ° = +11° 1,0, etanol). Etanolos oldatában vizsgált ultraibolya abszorpciós spektrumában a 225, 274, 282, 303 és 355mju-os hullámhosszakon látszik elnyelési maximum, E{^m : 309,3, 36,67,45,01, 70 és 20, sorrendben. A 37 277 jelű vegyület infravörös abszorpciós spektrumát az 1. ábrán adjuk meg. A kloroformos oldatban vizsgált spektrum az infravörös tartományban a következő: 3,05, 3,40, 5,70, 5,77, 5,93, 6,07, 6,62, 6,82, és 7,67 ju. A Craig-megoszlással kapott, 36 753 és 36 926 jelű vegyületeket tartalmazó frakciókat csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékként kapott terméket etil-acetátban oldjuk, az oldathoz szilikagélt adunk, és keverjük a szuszpenziót A szűrés után kapott szűrletet csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékot etil-acetátban oldjuk, az oldathoz hexánt adunk. Ekkor csapadék válik ki, amelyet kevés kloroformban oldunk, és etil-acetáttal készült, 6,0 pH-ra pufferezett szilikagél kromatografáló oszlopon kromatografálunk. Az eluálást etil-acetát, tetrahidrofurán és hexán 80 : 20 : 20 arányú, pH 6,0 vizes foszfát pufferrel telített elegyével végezzük 5,44 atü nyomáson. Az első 17, egyenként 20 ml térfogatú eluátum sárga színű olajat tartalmaz, ezeket kiontjuk. A 26-40. eluátum sok 36 926 jelű anyagot tartalmaz. A 41— 50 eluátumokban elsősorban a 36 926 és 35 763 jelű vegyületek vannak jelen. A 26—40. eluátumokat egyesítjük, csökkentett nyomáson desztilláljuk és szilikagél oszlopon ismét kromatografáljuk, miközben 20 ml térfogatú eluátumokat különítünk el. Az első 15 eluátum sárga színű olajat tartalmaz, ezeket kiontjuk. A 16-30. eluátumban elsősorban 36 926 jelű anyag van. A 31^0. eluátum a 36 926 és 35 763 jelű vegyületek keverékét tartalmazza. A 16-30. eluátumokat egyesítjük, csökkentett nyomáson desztilláljuk, a desztillációs maradékot kevés kloroformban oldjuk, majd kloroformmal készült, 6,0 pH-ra pufferezett szilikagél oszlopon kromatografáljuk. Az eluálást kloroform és etanol 95,5 :4,5 térfogatarányú telegyével végezzük 8,8 atü nyomáson, miközben 160, egyenként 6 ml térfogatú frakciókat különítünk el. A 60—90. eluátum az analízis szerint csak a 36 926 jelű vegyületet tartalmazza. Ezeket egyesítjük, és csökkentett nyomáson desztilláljuk az oldatot. A desztillációs maradékot a lehető legkevesebb etanolban oldjuk, az oldathoz étert adva pedig kicsapjuk a terméket, amikor tiszta, amorf 36 926 jelű vegyületet kapunk. A 36 926 jelű anyag metanolban, etanolban, kloroformban és metilénkloridban oldódik. Nem oldódik dietil-éterben, hexánban és heptánban. A 36 926 jelű vegyület nem rendelkezik határozott olvadásponttal. A bomlás 100 C° hőmérsékleten következik be. Az elemanalízis szerint a következő elemösszetételű: 7
