170669. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
3 170669 4 a) kromofór termékeket képezhetnek, amelyek spektrofotometriás úton könnyen mérhetők és fényabszorpciós maximumuk nem esik egybe az eredeti amid-reagensekével, vagy b) fluoreszcens termékeket képezhetnek, amelyek fluoreszcencia-spektrofotometriás úton mérhetők, vagy c) olyan termékeket képezhetnek, amelyek megfelelő reagensekkel kapcsolva fotometriás úton nagy érzékenységgel mérhető anyagokat szolgáltatnak. A kromofór csoportok felhasználásával végzett analitikai eljárásokat az Arch. Biochem. Biophys. 95, 271 (1961) és a Biochemistry 5, 169 (1966) közlemények részletesen ismertetik. A gyakorlatban már felhasználtak néhány hidrolizálható kromofór csoportot tartalmazó szintetikus amidreagenst. Ilyen reagenseket ismertet az Int. J. Peptide Protein Res. 4, 347 (1972) és 7, 91 (1975), valamint a Bull. Chem. Soc. Japan 43, 2900 (1970) közlemény. Az ismert reagensek túlnyomórészt Na-helyettesítetlen és Na -helyettesített mono-aminosav-p-nitro-anilid-származékok és mono-aminosav-ß-naftilamid-szarmazekok. E vegyületek közül az Na-benzoil-DL-arginin-p-nitro-anilid-hidrokloridot (BAPNA) a tripszin (E. C. 3. 4. 4.) meghatározására és a tripszin jelenlétében végbemenő reakciók követésére alkalmazzák. Ez a reagens az enzimes hidrolízis során kromofór termékként p-nitro-anilint képez, amely spektrofotometriás úton könnyen mérhető. Az ismert amid-szubsztrátumok specifitása és érzékenysége azonban nem megfelelő. A reagensek e hátrányos tulajdonsága következtében a meghatározáshoz viszonylag nagy mennyiségű biológiai eredetű anyagra van szükség, amelynek összegyűjtése gyakran nehézségekbe ütközik. További hátrányt jelent, hogy az enzimes reakció hosszú időt vesz igénybe, és a meghatározás pontossága nem kielégítő. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az (A) általános képletű új, kromofór csoportot tartalmazó tripeptid-származékok és ezek savaddíciós sói peptid-peptidohidrolázokkal szemben rendkívül érzékenyek. A képletben az aminosavak konfigurációja L, D vagy DL, Rj hidrogénatomot, 1—4 szénatomos alkanoil-csoportot vagy benzoil-csoportot jelent, R2 hidrogénatomot vagy ciklohexil-csoportot jelent, X jelentése metilén-csoport vagy vegyértékkötés, R3 3—5 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoportot vagy 3—8 szénatomos gyűrűs alkil-csoportot jelent, R4 3—5 szénatomos egyenes vagy elágazó láncú alkilesoportot vagy 3—8 szénatomos gyűrűs alkil-csoportot jelent, n értéke 3 vagy 4, R5 hidrogénatomot vagy amidino-csoportot jelent, és R6 nitrofenil-, naftil- vagy nitronaftil-csoportot jelent. Az (A) általános képletű új vegyületeket a találmány értelmében úgy állíthatjuk elő, hogy a megfelelő, adott esetben védőcsoporttal ellátott aminosavakat, karbonsavakat, aminokat vagy peptid-fragmenseket önmagában ismert módon a helyes sorrendben összekapcsoljuk egymással, az adott esetben jelenlevő védőcsoportokat lehasítjuk, és a megfelelő aminosavat, peptid-fragmenst vagy pepiidet a szintézis tetszés szerinti lépésében hexametilfoszforsav-triamidban valamely OCN—R6 általános képletű vegyülettel reagáltatjuk — ahol R6 jelentése a fenti —, vagy a megfelelő aminosavat, peptid-fragmenst vagy peptidet a szintézis tetszés szerinti lépésében vegyes anhidriddé alakítjuk, és az így kapott vegyes anhidridet valamely NH2 —R 6 általános képletű vegyülettel reagáltatjuk — ahol R6 jelentése a fenti. Kívánt 5 esetben az (A) általános képletű vegyületeket savaddíciós sóikká alakítjuk. A találmány értelmében tehát eljárhatunk úgy, hogy az R6 kromofór csoportot a peptid-lánc első aminosavjához kapcsoljuk, majd két további kapcsolási lépés-10 sei kialakítjuk a kromofór csoportot hordozó, (A) általános képletű tripeptidet, vagy a kromofór csoportot hordozó aminosavat egy előre elkészített dipeptiddel kapcsoljuk össze. Eljárhatunk továbbá úgy is, hogy az R6 kromofór csoportot a megfelelő dipeptidbe építjük 15 be, majd az így kapott vegyülethez kapcsoljuk az (A) általános képletnek megfelelő tripeptid utolsó aminosavrészét. Az (A) általános képletű vegyületeket végül úgy is előállíthatjuk, hogy először önmagában ismert módon kialakítjuk a tripeptid-vázat, majd a kapott tripep-20 tidhez kapcsoljuk az R6 kromofór csoportot. A peptid-származékok lépésről lépésre történő felépítésében a peptid-kémiában általánosan ismert és alkalmazott kapcsolási módszereket használhatjuk. Az amino-csoportok védelmére a peptid-kémiában általá-25 nosan ismert és alkalmazott védőcsoportokat, például benziloxikarbonil-csoportot (Cbo), metoxi-benziloxikarbonil-csoportot (MeOCbo), p-nitro-benziloxikarbonil-csoportot (NOe Cbo), p-metoxi-fenil-azo-benziloxikarbonil-csoportot (MCbo), terc-butoxikarbonil-cso-30 portot (BOC), trifluoracetil-csoportot (TFA) vagy formil-csoportot használhatunk. Az oc-helyzetű karboxilcsoport aktiválása során a megfelelő vegyületet a peptidkémiában általánosan alkalmazott ismert aktivált származékaivá, például p-nitro-fenil-észterré, N-hidroxi-35 -szukcinimid-észterré, savaziddá, szimmetrikus anhidriddé vagy vegyes anhidriddé alakíthatjuk. Ezeket az aktivált származékokat elkülöníthetjük, vagy közvetlenül tovább reagáltathatjuk. Az a-helyzetű karboxilcsoportot karbodiimiddel, például N,N-diciklohexil-40 karbodiimiddel is aktiválhatjuk. Az amino-peptid- vagy aminosav-származékok C-terminális karboxil-csoportját észterré, például metil-, etil- vagy izopropilészterré alakítva, vagy a kromofór anilin-csoport beépítésével védhetjük. A kromofór csoport ennek megfelelően a 45 peptid-lánc felépítése során a védőcsoport szerepét is betöltheti. A reakcióban részt nem vevő szabad funkciós csoportokat a peptidek vagy peptid-származékok szintézise során a következőképpen védhetjük: Az arginil-egység S-guanidino-csoportjának védel-50 mére a peptid-kémiában általánosan alkalmazható amino-védőcsoportokat, például —N02 csoportot vagy p-toluolszulfonil-csoportot (Tos) használhatunk, vagy a guanidino-csoportot protonfelvitellel védhetjük. A lizil-egység e-amino-csoportjára védőcsoportként benzil-55 oxikarbonil-csoportot (Cbo), terc-butoxikarbonil-csoportot (BOC) vagy p-toluolszulfonil-csoportot (Tos) vihetünk fel. A tirozin-egység hidroxil-csoportjának védelmére a peptid-kémiában általánosan alkalmazott hidroxil-védőcsoportokat, például benzil- vagy terc-60 -butil-csoportot használhatunk. A peptid-lánc lépésenkénti szintézise során az egyes új aminosavak bevitele után kapott termékeket gélszűréssel tisztíthatjuk. A tisztításhoz ismert gélszűrővel, például keresztkötéses dextrángéllel (Sephadex G vagy 65 LH, a Pharmacie Fine Chemicals cég gyártmánya, Upp-2
