170669. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzimek mennyiségének meghatározására, és eljárás a reagensek előállítására
5 170669 6 Sala, Svédország) vagy vinilacetát-kopolimer géllel (például Merckogel OR—PVA, az E. Merck A. G. cég gyártmánya, Darmstadt, Német Szövetségi Köztársaság) töltött oszlopot alkalmazunk. A gélt egyensúlyba hozzuk a megfelelő oldószerrel (például metanollal, etanollal, acetonnal, dimetilformamiddal, dimetilacetamiddal, dimetilszulfoxiddal vagy hexametilfoszforsavtriamiddal), majd ugyanezzel az oldószerrel eluáljuk. A peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzimek mennyiségének analitikai meghatározását a találmány értelmében úgy végezzük, hogy a vizsgálandó enzimet valamely (A) általános képletű vegyülettel — ahol az aminosavak konfigurációja, Klt R 2 , X, R3, R 4 , n, R 5 és R6 jelentése a fenti — vagy e vegyület savaddíciós sójával reagáltatjuk, a reakció során felszabaduló NH2 —R 6 általános képletű vegyület — ahol R6 jelentése a fenti — mennyiségét önmagában ismert fotometriás vagy spektrofotometriás módszerrel mérjük, és a mérési adatokból kiszámítjuk a peptid-peptidohidroláz-típusú proteolitikus enzim mennyiségét. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. Az eluátum és a termékek vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatához abszorpciós közegként szilikagél-réteggel (F 254, az E. Merck A. G. cég gyártmánya, Darmstadt, Német Szövetségi Köztársaság) bevont üveglemezt használtunk fel, míg futtatószerként az alábbi oldószerelegyeket alkalmaztuk: A: 3 : 1 : 1 arányú n-butanol : ecetsav : víz elegy C: 7 : 1 : 2 arányú n-propanol : etilacetát : víz elegy D: 3 : 2 : 1 arányú n-heptán : n-butanol : ecetsav elegy Px : 9 : 1 arányú kloroform : metanol elegy. Futtatás után a lemezeket először 254 nm hullámhosszú ultraibolya fényben, majd klór/toluidin reakcióval (G. Pataki: Dünnschichtchromatografie in der Aminosäure und Peptid-Chemie, Walter de Gruyter and Co., Berlin, 1966, 125. oldal) hívtuk elő. Amennyiben egyebet nem közlünk, a példákban említett aminosavak L-konfigurációjúak. A példákban a következő rövidítéseket használtuk: Arg =arginin Leu = leucin He = izoleucin Lys = lizin • Phe = fenilalanin Tyr = tirozin Val = valin CPh.Gly = C-fenil-glicin Ac = acetil-csoport Ac2 0 = ecetsavanhidrid AcOH = ecetsav BOC = terc-butoxikarbonil-csoport Bz = benzoil-csoport Bzl = benzil-csoport Bz2 0 = benzoesavanhidrid Cbo = benziloxikarbonil-csoport DCCI = diciklohexil-karbodiimid DCHA = diciklohexil-amin DCU = diciklohexil-karbamid DMF = dimetilformamid Et3 N = trietilamin HMPTA = N,N,N', N', N",N"-hexametil-foszforsav-triamid MCbo = p-metoxi-fenil-azo-benziloxikarboniI-csoport MeOH = metanol NA = naftilamin OtBu = terc-butoxi-csoport OEt = etoxi-csoport OMe = metoxi-csoport OpNP = p-nitro-fenoxi-csoport OizoPr = izopropoxi-csoport pNA = p-nitro-anilid-csoport TFA = trifluoracetil-csoport Tos = 4-toluolszulfonil-csoport A gélszűréshez Sephadex G—15 és G—25 gélt hasz-15 náltunk fel. Mindkét anyag keresztkötéses dextrángél, amelyek a térhálósság fokában különböznek egymástól. A példákban említett Sephadex LH—20 gél hidroxipropilezett keresztkötéses dextrángél. A Sephadex megjelölésű gélek a Pharmacia Fine Chemicals cég (Uppsala, 20 Svédország) termékei. 1. példa 25 H-Leu-Leu-Arg-pNA.2HCl(I) a) lépés: Cbo-Arg(N02 )-pNA (la) 35,3 g (0,1 mól) száraz Cbo-Arg(N02 )—OH 200 ml frissen desztillált HMPTA-val készített oldatához szo-30 bahőmérsékleten, keverés közben, a nedvesség kizárásával 10,1 g (0,1 mól) Et3 N-t és 24,6 g (0,15 mól) p-nitro-fenil-izocianátot adunk. Az elegyet 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd keverés közben 2 liter 2%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldatba öntjük. 35 A kivált csapadékot leszűrjük, 3 X 0,5 liter 2%-os vizes nátriumhidrogénkarbonát-oldattal, 2X0,2 liter desztillált vízzel, 2 X 0,5 liter 0,5 n sósavoldattal, végül 5 X0,2 liter desztillált vízzel mossuk. A csapadékot szárítjuk, majd a nyers terméket meleg metanolban 40 szuszpendáljuk. Az N.N^bisz-p-nitro-fenil-karbamidból álló oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szűrletet metanollal egyensúlyba hozott Sephadex LH—20 gélen ismét szűrjük. 29,8 g (63,0%) (la) képletű vegyületet kapunk, amely 45 vékonyrétegkromatográfiásan (futtatószer: Pj, illetve C elegy) egységes. Op.: 185—188 °C, [cx.]%= -1,3° (c = 1,1, ecetsavban). b) lépés: Cbo-Leu-Arg(N02)-pNA (Ib) 50 5,0 g (10,6 mmól) (la) képletű vegyületet a nedvesség kizárása mellett 21 ml ecetsav és 22 ml 4 n ecetsavas brómhidrogénsav-oldat elegyében oldunk. A reakcióelegyet 1 órán át keverjük, majd lassú ütemben, erélyes keverés közben 200 ml éterbe öntjük. H-Arg(N02 )-55 -pNA.1,5 HBr válik ki. Az éteres fázist dekantálással elkülönítjük, és a szemcsés maradékot az ecetsav és brómhidrogénsav-fölösleg, valamint a benzilbromid melléktermék eltávolítása érdekében 3 X 100 ml éterrel mossuk. A terméket vákuumban foszforpentoxid fölött 60 szárítjuk. 4,87 g (100%) hidrobromid-sót kapunk. 4,87 g (10,6 mmól) H-ArgíNO^-pNA.U HBr-t 50 ml desztillált dimetilformamidban oldunk. Az oldatot —10 °C-ra hűtjük, és a bázis felszabadítása érdekében 1,6 g (15,9 mmól) Et3 N-t adunk hozzá. A reakció-65 elegyet 1 órán át vízmentes körülmények között tartjuk. 3
