170665. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminocukor származékok tiszta állapotban való elkülönítésére keverékeikből
5 Í7Ó665 6 alábbís a homológok nagyon szűk tartományát állíthatjuk elő közel szelektíven. Olyan táptalajokban, amelyek 2% feletti mennyiségű keményítőt tartalmaznak, mindenek előtt 4—7 hexózegységet tartalmazó (vagyis nt + n 2 = 4—7) aminocukor-származékok képződnek és erre a célra különösen az SE 50/13 (CBS 614.71) törzs alkalmas. Bizonyos körülmények között azonban már az is elegendő, ha a táptalajokhoz, amelyek például alap-szénforrásként 3,5% glükózt tartalmaznak, 0,1— 3%, előnyösen 0,5—2% keményítőt adunk ahhoz, hogy 4—7 hexózegységet tartalmazó aminocukor-származékok keverékét kapjuk. Azt találtuk továbbá, hogy keményítő-mentes táptalajokban és különösen akkor, ha a táptalajhoz maltózt adunk, különösen az SE 50 (CBS 961.70) törzzsel túlnyomórészt 2—3 hexózegységet tartalmazó aminocukor-származékokat állíthatunk elő. Az olyan aminocukor-származék előállítására, amelyben a hexózegység glükózcsoport, különösen alkalmasnak bizonyultak az olyan táptalajok, amelyek szénforrásként egyedül glükózt tartalmaztak. Ha a táptalaj glükóz-felesleget tartalmaz, hosszabb időn át tartó fermentálás esetén hosszabb szénláncú aminocukor-származékok is képződnek. Ezt bizonyos határok között azáltal kerülhetjük el, hogy a fermentáció során a nitrogénforrások kimerülése időben összeesik a glükóz kimerülésével. Ha olyan táptalajokat használunk, amelyek nem tartalmaznak glükózt és szénforrásként maltózt adagolunk, túlnyomórészt 2 hexózegységet tartalmazó aminocukor-származékot kapunk. Ekkor a tiszta maltózt olcsóbb keverékekkel is helyettesíthetjük, így például Maltzin-nal, amely természetes malátaextraktum (gyártja a Diamait AG., München). A maltotrióztartalom szerint hosszabb láncú homológok is képződnek. Rövidebb láncú homológok előállítására különösen alkalmasnak bizonyult az SE 50/110 törzs, amely optimális táptalajokban körülbelül kétszeres kitermeléssel szolgáltatja a rövid szénláncú homológokat, mint az SE 50/13 törzs. A fermentációk során a táptalaj összetételét, különösen a nitrogénforrások koncentrációját és a só-összetételt széles határokon belül változtathatjuk. A táptalajokat a szokásos módon sterilizáljuk. A táptalaj pH-értéke 5,0—8,5, előnyösen 6,0—7,80. A tenyésztési hőmérsékletek 15 °C és 45 °C közöttiek, előnyösen 24 °C és 32 °C közöttiek. Hosszabb láncú homológok SE 50 és SE 50/13 jelzésű törzsekkel végzett előállításakor magasabb hőmérséklet, például 28 °C és rövidebb láncú homológok SE 50 és SE 50/110 jelzésű törzsekkel végzett előállításakor alacsonyabb hőmérséklet, például 24 °C az előnyösebb. A tenyésztés időtartama 1—8 nap, előnyösen 2—6 nap. Hosszabb tenyésztési idő, különösen szénhidrát felesleg esetén a hosszabb homológok képződésének kedvez. A fermentáció végpontját a gátló aktivitás enzimatikus gátló próbában végzett meghatározásával és az összetétel vékonyrétegkromatográfiás meghatározásával állapítjuk meg. A találmány szerinti aminocukor-származékok rövid láncú homológjait a hosszabb láncú homológok hexózegységeinek lehasításával is előállíthatjuk. A lehasítást vizes savakkal különösen 1—5 n ásványi savakkal végezzük 50—100 °C, különösen 90—100 °C hőmérsékleten 10—180 perc alatt, vagy enzimekkel (hidrolázokkal), különösen ß-amüazokkal vagy nem gátolható a-amilázokkal vagy mikrobás eredetű aminoglükozidázokkal, így például B. subtilis-ből előállított a-amilázokkal végzett inkubálással vagy olyan mikroorganizmusokkal végzett inkubálással, amelyek képesek olyan táptalajokban növekedni, amelyek egyedüli szén-5 forrásként a találmány szerinti aminocukor-származékok hosszabb láncú homológjait tartalmazzák 1—10%, előnyösen 2—5% mennyiségben; ilyen például az Aspergillus niger (ATCC 11.394). A találmány szerinti aminocukor-származékok tisz-10 títását és elkülönítését vagy a tenyészfolyadékokból kiindulva végezzük vagy az olyan savas hidrolizátumokból vagy inkubációs elegy ékből kiindulva, amelyekben az aminocukor-származékok hosszabb láncú homológjainak enzimatikus és/vagy mikrobiológiai lebontását 15 megvalósítottuk. Miként említettük, az elkülönítendő anyagok molekulasúlytartománya szerint különböző feldolgozási módszerekre van szükség. Hosszabb láncú homológok esetében az elkülönítést közvetlen kicsapással végezzük 20 az oldatok előzetes színtelenitése és betöményítése után [lásd például a b) eljárásváltozatot]. A kisebb molekulájú homológokat ezzel szemben előnyösen semleges pH-értéken aktív szénnel végzett adszorpcióval, majd ezt követő, vizes alkoholokkal vagy 25 acetonnal, előnyösen 50—80%-os acetonnal végzett deszorpcióval nyerjük ki [lásd az a) eljárásváltozatot]. A deszorpciót különösen akkor tehetjük teljessé, ha savas pH-értéken végezzük, 1,5—4 pH tartományban, előnyösen 2—3 pH-értéken. 30 Ha a kiindulási oldatok nagyon sötétre színezettek, a találmány szerinti anyagok adszorpciója előtt savas pH-értéken (pH = 1—3) aktív szénnel vagy nem specifikus adszorpciós gyantákkal, például Lewapol-lal (Ca 9221) 0,35 mm szemcsenagyság, gyártja Bayer AG.), 35 2—7 pH-tartományban, előnyösen 2—3 pH-értéken színtelenítjük ezeket. Az aktív szén csak savas tartományban köti meg előnyösen a színanyagokat, míg a Lewapol találmány szerinti aminocukor-származékokat mind semleges, mind savas közegben adszorbeálja. 40 Az inaktív szacharidok és egyéb inaktív vegyületek gátló hatású aminocukor-származékainak elválasztásához kihasználjuk ezeknek a komponenseknek a gyengén bázikus jellegét. Alkalmas körülmények között (pH = l—8, előnyösen 2—4; 10 mS-nél kisebb, elő-45 nyösen 2 mS-nél kisebb vezetőképességnek megfelelő alacsony ionerősségnél) az erősen savas kationcserélők, így például a Dowex 50 W (gyártja Dow Chemicals) a H+-alakban megkötik a homológ aminocukor-származékokat. Különösen jól köthetők meg kationcseré-50 lökön a gátló hatású aminocukor-származékok — vizsgálataink szerint — acetonos oldatból (50—80% aceton, pH = 1—5, előnyösen 2—4), amely kationcserélők ilyen körülmények között jelentős kapacitást mutatnak ilyen anyagokkal szemben. Olyan feltétel mellett, hogy 55 az oldat több, mint 50% acetont tartalmazzon, a megkötés gyengén savas ioncserélőn is jól sikerül, például H+ -alakban levő Amberlite IRC—50-en. A találmány szerinti aminocukor-származékok kationcserélőkről történő deszorbeálásához vizes bázisokat 60 vagy savakat, előnyösen ammóniát vagy sósavat használunk 0,01—1 Val/liter koncentrációban [lásd az a) eljárásváltozatot]. A deszorbátumokból az inhibitor hatású aminocukor-származékokat — a deszorbátum megfelelő, gyengén savas, illetve lúgos ioncserélővel tör-65 ténő semlegesítése vagy ha a bázis, illetve sav illó, vá-3
