170665. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminocukor származékok tiszta állapotban való elkülönítésére keverékeikből
21 170665 22 3. példa 1 literes, 120 ml, 4% keményítőből, 2,4% glükózból, 0,9% kazeinhidrolizátumból és 0,9% élesztőextraktumból álló táptalajt tartalmazó Erlenmeyer-lombikot, ahol a táptalaj pH-értékét nátriumhidroxiddal 7,6-ra állítottuk be, összekevertük 0,4% kalciumkarbonáttal és 30 percen át sterilizáltuk 121 °C-on, beoltunk az SE 82 jelű törzs előkultúrájának 3 ml-ével, amelyet úgy állítottunk elő, hogy a törzset 2% keményítőből, 1% glükózból, 0,5% kazeinhidrolizátumból és 1% élesztőextraktumból álló, nátriumhidroxiddal 7,2 pH-értékre beállított, 0,4% kalciumkarbonáttal összekevert és 30 percen át 121 °C-on sterilizált táptalajban tenyésztettük, 5 napon át tenyésztjük 28 °C-on rázógépen, így 122 000 AIE/ml aktivitású tenyészfolyadékot kapunk. Feldolgozás céljából az egyesített tenyészfolyadékok micéliumát 12 000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással elválasztjuk, a tenyészszűrlet 300 ml mennyiségének pH-ját kétszeresre hígított tömény salétromsavval 2,5-re állítjuk be, és 10 percen át keverjük 2,5 g p. a. aktív szénnel. A szenet 12 000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással elválasztjuk, az oldat pH-ját 10 n káliumhidroxiddal 6-ra beállítjuk, összekeverjük 300 ml metanollal, rövid ideig állni hagyjuk, és a csapadékot 12 000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással eltávolítjuk. Ezután a felső íéteget 3 liter etanolba csepegtetjük, rövid idő múlva az állás során kivált csapadékot 12 000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással elkülönítjük, a csapadékot kétszer mossuk száraz etanollal és egyszer vákuumban szárítjuk, így 2,23 g terméket kapunk, amelynek aktivitása 7,45 X106 AIE/g, amely 95%-nál nagyobb menynyiségben tartalmazza az aminocukor-származékok magasabb homológjait, amelyekben nx + n 2 összege 4 feletti. 4. példa 1 literes Erlenmcyer-lombikban levő 120 ml táptalajt, amelynek összetétele 3,5% glükóz, 2% keményítő, 0,5% kazeinhidrolizátum, 1,3% élesztőextraktum, 0,3% kalciumkarbonát és 0,3% K2 HP0 4 , amelyet sterilizálás előtt 7,8 pH-értékre állítottuk be és 30 percen át sterilizáltunk 121 °C-on, beoltunk az SE 50/110 jelzésű törzs olyan előkultúrájának 6 ml-ével, amelyet 3% szójalisztből, 3% glicerinből és 0,2% kalciumkarbonátból álló táptalajjal készítettünk és 3—4 napon át tenyésztjük 24 °C-on, rázógépen; így olyan tenyészfolyadékot kapunk, amelynek aktivitása 153 000 AIE/ml és 12 200 SIE/liter. A tenyészfolyadék 1 literét salétromsavval 2,5 pH-értékűre állítjuk be, 10 percen át keverjük 5 g aktív szénnel, majd 30 percen át centrifugáljuk 5000 fordulat/perc sebességgel. Ezt követően 25 g Amberlite IRA 410 (OH~-alak) hozzáadásával semlegesítjük. A semleges felső réteget 100 ml térfogatra bepároljuk, összekeverjük 100 ml metanollal és szűrjük. A szűrletet 2 liter száraz alkoholba belekeverjük, a kivált csapadékot leszűrjük, háromszor mossuk acetonnal és éterrel, majd vákuumban megszárítjuk. így 14 g fehérszínű poralakú termékkeveréket kapunk, amelynek aktivitása 5 X 106 AIE/g, a termékkeverék 85% mennyiségben pedig olyan homológokat tartalmaz, amelyekben nx + n 2 összege 4 feletti. 5. példa A 4. példa szerinti módon járunk el, azonban 0,5% keményítőt adunk a táptalajhoz; így 4 napon át tartó 5 fermentálás után olyan tenyészfolyadékot kapunk, amelynek aktivitása 40 000 AIE és 184 SIE/ml. A tenyészfolyadék olyan homológot tartalmaz 10% menynyiségben, amelyben n1 +n 2 = l. A többi homológ mennyisége: n1 +n 2 =2 = 15%, n x + n 2 = 3 = 5%, 10 ni +n 2 =4 = 8%, ni +n 2 :=5=7%, n x +n 2 >5 = = 60%. 6. példa 15 1 literes Erlenmeyer-lombikban levő 120 ml olyan táptalajt, amelynek összetétele 3% glükóz, 0,5% kazeinhidrolizátum, 1,6% élesztőextraktum, 0,3% kalciumkarbonát és 0,3% K2 HP0 4 és amelynek pH-ját sterili-20 zálás előtt káliumhidroxiddal 7,8-ra állítottuk be, beoltjuk az SE 50/110 jelzésű törzs olyan előkultúrájával, amelyet a 4. példa szerinti módon állítottunk elő, és 4 napon át tenyésztjük 24 °C-on rázógépen; így 10 800 SIE/liter aktivitású tenyészfolyadékot kapunk, amely 25 túlnyomórészt olyan aminocukor-származékot tartalmaz, amelyben nx + n 2 = 1. A tenyészfolyadékból a micéliumot 13 000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással elválasztjuk; 5 liter tenyészfolyadék pH-ját duplájára hígított 30 salétromsavval 2,5-re állítjuk be és 15 percen át keverjük 55 g aktív szénnel (Merck) és 200 g Clarcel-lel. A szilárd anyagokat szűréssel eltávolítjuk, az oldatot koncentrált ammóniával pH =7-ig semlegesítjük, 1,5 liter térfogatra bepároljuk és ötszörös mennyiségű etanol-35 lal lecsapjuk. A keletkező pelyhes csapadékot folytonos üzemű centrifugán 12 000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással elválasztjuk, a sárgásszínű felső réteget 150 ml térfogatra bepároljuk és a kis mennyiségű oldhatatlan anyagot centrifugálással elválasztjuk. Az 40 oldat 50 ml-ét Amberlite IR—120 (H+-alak) ioncserélővel töltött oszlopra visszük fel (30X300 mm; 30 ml víz/óra), összesen 300 ml eluátumot fogunk fel, amely inert szacharidokat, valamint a nem adszorbeált gátlóhatású komponensek egy részét tartalmazza, ezután az 45 ioncserélőt körülbelül 400 ml vízzel főzőpohárba viszszük át, és keverés közben tömény ammóniát adunk hozzá 11,5 pH-érték eléréséig. 30 percen át tovább keverjük, ezután elválasztjuk az ioncserélőtől, térfogatának 1/20-ad részére betöményítjük, Amberlite IRA—410 50 (HCOá-alak) ioncserélőt tartalmazó oszlopon (20 X150 mm) keresztül szűrjük és 30 ml/óra átfolyási sebesség mellett körülbelül 500 ml eluátumot fogunk fel. Ezt betöményítjük és liofilizálás után 1,3 g nyers terméket kapunk. 55 További tisztítás céljából a nyers terméket 100—200 mesh-méretű Bio—Gel P—2 (gyártja Bio—Rad, München) gélen frakcionáljuk. Ehhez 50 mm átmérőjű és 450 mm hosszúságú oszlopot használunk, amely vízzel 40 ml/óra átfolyási sebesség mellett működik; 10 ml 60 térfogatú frakciókat gyűjtünk össze. Minden frakciót megvizsgálunk az antron-próba segítségével szénhidrátra, valamint a szacharáz gátló próba segítségével inhibitor hatású komponensekre. A szacharáz inhibitort tartalmazó frakciókat továbbá vékonyrétegkromatog-65 ráfiásan is megvizsgáljuk a második példa szerinti mó-11
