170665. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminocukor származékok tiszta állapotban való elkülönítésére keverékeikből
23 Í70665 24 don, így meghatározzuk az egyes komponensek mennyiségét. Azokat a frakciókat, amelyek olyan aminocukorszármazékot tartalmaznak, amelyben nx +n 2 = 1, egyesítjük, bepároljuk és liofilizáljuk. 35 g aminocukorszármazékot kapunk, amelyben n1 +n 2 = l és amelynek aktivitása 0,3 X 106 AIE/g és 30 000 SIE/g. 7. példa 1 literes Erlenmeyer-lombikban levő 120 ml olyan táptalajt, amelynek összetétele 5% keményítő, 1% élesztőextraktum és 0,2% K2 HP0 4 , beoltunk a 4. példa szerinti előkultúra 2—2 ml-ével és 3 napon át tenyésztjük 28 c C-on, így olyan tenyészfolyadékokat kapunk, amelyek az alábbi mennyiségű amiláz-inhibitort tartalmazzák: törzs AIE/ml SE 50 37 000 SE 50/13 109 000 SE 50/110 53 500 A termék 93—97%-ban olyan aminocukor-származékot tartalmaz, amelyben nt + n 2 = 4, továbbá a 100%-ból visszamaradó mennyiségben magasabb homológokat is tartalmaz. 8. példa 1 literes Erlenmeyer-lombikokban levő 120—120 ml olyan táptalajt, amelyeknek összetétele l,3%.maltóz, 3,5% glükóz, 0,5% kazeinhidrolizátum, 1,3% élesztőextraktum, 0,3% kalciumkarbonát és 0,3% K2 HP0 4 , beoltunk a 4. példa szerinti előkultúra 2—2 ml-ével. 4 napon át tenyésztjük rázógépen, 24 °C-on különböző törzsekkel, így az alábbi hozamokat kapjuk: törzs SIE/ml AIE/ml SE 50 25 580 SE 50/13 14,8 1460 SE 50/110 57,9 755 A termék 75—80%-ban olyan aminocukor-származékot tartalmaz, amelyben nx + n 2 = 4, továbbá a 100%-ból visszamaradó mennyiségben magasabb homológokat is tartalmaz. 9. példa Fermentorban levő olyan táptalajt, amelynek összetétele 3,5% glükóz, 2,5% malátaextraktum (száraz por), 0,5% kazeinhidrolizátum, 1,3% élesztőextraktum, 0,3% kalciumkarbonát, 0,3% K2 HP0 4 és 0,1% habzásgátlószer, beoltunk a 4. példa szerinti előkultúra 5 literével, és keverés és levegőztetés közben 5 napon át tenyésztjük 24 °C-on. így olyan tenyészfolyadékot kapunk, amelynek aktivitása 73 000 SIE/liter, és a képződött inhibitorok összmennyiségére vonatkoztatva 85%-ban olyan aminocukor-származékot tartalmaz, amelyben nx + n 2 = = 2. 90 liter fermentlevet micéliummal együtt 2,5 pH-értékre állítunk be tömény salétromsavval, miközben a pH-t pH-mérővel mérjük, és keverés közben 900 g (1%) aktív szénnel (Merck) adszorbeáljuk a képződött színező anyagok főtömegét. 15 percen át keverjük, ezután a micéliumot 3000 fordulat/perc sebességgel végzett 5 centrifugálással elválasztjuk (így elválasztjuk a szén főtömegét is) és a felső réteget ezután 3 kg Clarcel hozzáadása közben nyomószűrőn szűrjük. így 65 liter sárgásbarna, tiszta szűrletet kapunk, amelynek aktivitása 60 000 SIE/liter. 10 A szűrlet pH-ját koncentrált ammóniával 7-re beállítjuk, és a hatóanyag adszorbeálása céljából 30 percen át keverjük 1300 g (2%) aktív szénnel (Merck). Nyomószűrőn át szűrjük, és az aktív szén üledéket 3 X10 liter desztillált vízzel mossuk. Ezután a szenet szárazra le-15 szívatjuk és 3 X 4 liter 50%-os acetonban 2,5 pH-értéken 15 percen át keverjük, hogy a hatóanyagot a szénről deszorbeáljuk. Az acetonos deszorbátumokat a szén szűréssel való elválasztása után egyesítjük. Az egyesített deszorbátumot rotációs bepárlóban 250 ml térfogatra 20 bepároljuk, azonos térfogatrész (250 ml) metanollal öszszekeverjük és redős szűrőn szűrjük. A szűrletet (480 ml) erős keverés közben 5 liter acetonba becsepegtetjük. A levált csapadékot szűrjük, és acetonnal és éterrel háromszor mossuk. Ezt követően vákuumban 35 °C-on 25 szárítjuk. Hozam: 230 g, aktivitás 8500 SIE/g. A fenti nyers termék 25 g-ját 1 liter vízben feloldjuk, és 30 percen át keverjük 300 g Dowex 50 WX 4 H+ (200 = 400 mesh) ioncserélővel. Ezután a gyantát kiszűrjük, és 3 X 2 liter 0,001 n sósavval utánamossuk. 30 Ezután a lemosott gyantát 500 ml vízben szuszpendáljuk, és a szuszpenzió pH-ját pH-mérővel ellenőrizve 9,0-ra állítjuk be 25%-os ammónia hozzáadásával. Ezután még kétszer 500—500 ml 0,6%-os ammóniával deszorbeáljuk, a deszorbátumokat egyesítjük, és rotá-35 ciós bepárlóban 100 ml térfogatra bepároljuk. A koncentrátum színtelenítése céljából 5 percen át keverjük 2 g DEAE-cellulózzal (gyártja Schleicher und Schüll, Nr. 02035, 0,6 mVal/g), majd centrifugáljuk. A világossárgaszínű felső réteget azonos térfogatrész (100 ml) 40 metanollal összekeverjük, majd erő^ keverés közben becsepegtetjük 2 liter acetonba. A csapadékot leszűrjük, acetonnal és éterrel mossuk, és vákuumban 35 °C-on szárítjuk. Hozam: 4,2 g, aktivitás 26 000 SIE/g. További tisztítás céljából 4,0 g inhibitort 0,5 g-os ada-45 gokban Biogel P—2 gélen szűrünk. Ekkor a készítmény 0,5—0,5 g-os adagjait 10 ml vízben feloldjuk, és 5 cm átmérőjű és 95 cm hosszú Biogel P—2 oszlopra viszszük fel (200—400 mesh, gyártja Bio-Rad). Vízben fejlesztjük ki 80 ml/óra átfolyási sebességmellett. 12ml-es 50 frakciókat gyűjtünk össze. Meghatározzuk az összes frakció össz-szénhidrát-tartalmát (antron-próbával mint extinkciót E620 -on), valamint a szacharáz és amiláz inhibitor tartalmat. Ezenkívül megvizsgáljuk a frakciókat vékonyrétegkromatográfiásan is (2. példa szerinti 55 enzim-inhibitor elszíneződés). Azokat a frakciókat, amelyekben olyan aminocukorszármazékokat mutattunk ki, ahol % + n2 = 4—6, egyesítjük, vákuumban 10 ml térfogatra bepároljuk, és 200 ml száraz alkoholba való becsepegtetéssel lecsapjuk. 60 A csapadékot centrifugáljuk, acetonnal és éterrel mossuk, és vákuumban szárítjuk. Hozam: 4,0 g nyers inhibitorból 0,2 g olyan aminocukor-származék, amelyben ni+n 2 =4—6 és aktivitása 17,5 X10 6 AIE/g és 8500 SIE/g. Az olyan frakciókat, amelyek olyan aminocukor-65 származékot tartalmaznak, amelyben nx + n 2 = 3, ugyan-12
