170522. lajstromszámú szabadalom • Eljárás élő legyengített influenza-vírustörzsek és ezeket tartalmazó vírus-vakcinák előállítására
170522 A hemagglutináció-gátló kísérletekben megállapítottuk, hogy az inhibitor-rezisztencia nem módosítja a vírus menyéteken jelentkező antigén hatását: a beoltott álatok vérszérumának antitest-faktora 14 nappal az intranazális beoltás után (1/256) a kontroli-csoportban észlelt faktorhoz (<l/8) viszonyítva igen magas volt, 3) Az EID5 o/(AOS)ID S o arány (AOS-érték) meghatározása: A fenti inokulumokat embriót tartalmazó tojásokon és héjas allantoisz-hártyákon titrájuk (a héjas allantoisz-hártyán végzett titrálást a J. Hyg. 56, 151-162 (1958) közlemény ismerteti). A Brigit-törzs EIDs o/(AOS)IDso aránya e kísérletben <102,s volt. A <10 2,s arányt a továbbiakban „pozitív"-ként értékeljük. 10 15 4) A hemagglutinin hőmérsékletérzékeny jellegének vizsgálata: 1 órán át 60 C°-on inkubált fertőző allantoisz-folyadékon hemagglutinációs kísérletet végzünk. A Brigit-törzs (ATCCVR786) e hőkezelés hatására teljes mértékben elvesztette hemagglutináló képességét. Ezt a hőmérséklet érzékeny jelleget a továbbiakban „pozitív"-ként értékeljük. 5) Juh-vörösvérsejtekkel 30C°-on végrehajtott hemagglutinációs kísérletek: Juh-vörösvérsejteken 4 C°-on, illetve 30 C°-on hemagglutinációs kísérleteket végzünk. A törzs hemagglutináló képessége 4 C°-on normális volt, míg 30 C°-on gyors kioldást észleltünk, azaz nem tapasztaltunk jól definiált hemagglutinációt A kísérlet kezdetétől számított 20 óra elteltével a hemagglutináció teljes mértékben visszaszorult. Az ilyen típusú hemagglutináló képességet a továbbiakban „instabil"-nak nevezzük. 20 25 30 35 40 2. példa B-típusú, B/HK/5/72 jelű influenza-vírustörzs (ATCCVR791) 0,2 ml-es mintáját 10-11 napos, embriót tartalmazó tojások allantoisz-üregébe fecskendezzük, majd nagymennyiségű vírus termelése érdekében három lépésben tenyésztjük. (Az ATCC VR791 törzs hemagglutininje eltér a Brigit-törzs (ATCCVR786) hemagglutininjétől.) A harmadik lépés után 108 EID s0 /ml faktorú vírus-szuszpenziót kapunk. A hígítatlan szuszpenzió 0,2 ml-es mintáit embriót tartalmazó, specifikus patogénmentes (SPF) tojások allantoisz-üregébe fecskendezzük, és a rendszert 2 órán át 33 C°-on inkubáljük. Ezután a tojásokba a Brigit-törzs (ATCCVR786) 0,2 ml térfogatú, 10 EIP 50/ml faktorú szuszpenziót fecskendezzük. A tojásokat további 16 órán át 33C°-on inkubáljük, majd az allantoisz-folyadékot elkülönítjük. „Anti-Brigit törzs" szérumtípusú nyúlszérumot 1 órán át 56 C°-on tartjuk, majd a szérum 0,25 ml-es mintáit azonos térfogatú normál szérummal elegyítjük. Az így kapott szérum-elegy 0,25 ml-es mintáit az elkülönített allantoisz-folyadékhoz adjuk, majd a rendszert 1 órán át 37C°-on tartjuk. Az így kapott, inkubált elegyek 0,2 ml-es mintáit embriót tartalmazó tojásokba fecskendezzük (minden egyes kísérlethez 2 tojást használunk fel), majd a rendszert 48 órán át 33C°-on inkubáljük. A tojások allantoisz-folyadékát elkülönítjük, az allantoisz-folyadékot 0,2 ml-es részletekben embriót tartalmazó tojásokba fecskendezzük, majd a tojásokat 72 órán át 33C°-on inkubáljük. Ebben az esetben is minden egyes kísérlethez 2 tojást használunk fel. Az inkubálás után elkülönítjük a pozitív allantoisz-folyadékokat, és a következő sajátságokat vizsgáljuk: juh-vörösvérsejtek hemagglutinálása, anti-Brigit-szérummal és anti-B/HK/5/72 szérummá szemben kifejtett hatás, nem specifikus szérum-inhibitorokkal szembeni rezisztencia, és növekedés tojáson és héjas allantoisz-üregben (AOS). Az eredményeket az 1. táblázatban ismertetjük. 1. táblázat Törzs Szérumtípus Brigit B/HK/5/72 Inhibitorrez. EIDso (AOS)ID50 Hemagglutinin hőérzékenysége Juh vörösvérsejtek hemaggl. 30 C°-on Brigit B/HK/5/72 + + + + + instabil stabil R22 + + Az így kapott vírus-szuszpenziók egyikét embriót tartalmazó tyúktojáson való véghígításos tenyésztésnek vetjük alá. Az így kapott klónt amely 60 az 1. táblázat adatai szerint a B/HK/5/72 alaptörzs antigén-szerkezetével rendelkezik, AOS-rendszeren meghatározott fertőzőképessége és szérum-inhibitor-rezisztenciája pedig azonos a Brigit-alaptörzsével, R 22 törzsnek neveztük el, és az American Type 65 + - stabil Culture Collection gyűjteményben ATCCVR788 számon helyeztük letétbe. Ezt a vírustörzset a törzs elszaporítása céljából embriót tartalmazó tyúktojásokon két lépésben tenyésztjük, majd az allantoisz-folyadékokat elkülönítjük, egyesítjük, 5%-os peptonkoncentráció eléréséig peptonnal elegyítjük, és fagyasztva szárítjuk. 4
