170522. lajstromszámú szabadalom • Eljárás élő legyengített influenza-vírustörzsek és ezeket tartalmazó vírus-vakcinák előállítására
170522 10 3. példa Azonos térfogatú B-típusú Brigit influenza vírus-szuszpenzió (ATCC VR786) és B/Hong-Kong/8/73 vírus-szuszpenzió (ATCCVR792) elegyét (mindkét szuszpenzió faktora 107 ' 5 EID 50 /ml) 72 órán át 4 C°-on előinkubáljuk, majd a kapott elegyet 2 db, embriót tartalmazó SPF-tyúktojás allantoisz-üregébe fecskendezzük. Mindkét tojásba 0,2 ml vírus-szuszpenziót fecskendezünk. 33C°-on 16 órán át végezett inkubálás után elkülönítjük a tojások allantoisz-folyadékát, és 30 másodpercig ultrahanggal besugározzuk. A hígítatlan, illetve a 10"1 és 10~ 2 koncentrációra hígított allantoisz-folyadékokat 1 órán át 37C°-on különböző hígítású anti-Brigit törzs szérumtípusú nyúlszérummá inkubáljuk. Felhasználás előtt a nyúlszérumot 30 percig 56C°-on hőkezeltük. A kapott elegyeket AOS-rendszerbe fecskendezzük, és 72 órán át 37C°-on inkubáljuk. Az utolsó pozitív vírus-hígításhoz (10~2 ) tartozó mintákat 1-től 7-ig terjedő számokkal jelöljük. Ezután meghatározzuk a hét minta fertőzőképességét és anti-Brigit szérum-semlegesítését, és a kapott adatokat összehasonlítjuk a két alaptörzsre meghatározott értékekkel. 5 Ezután összegyűjtjük azokat a mintákat, amelyeket a még pozitív reakciót adó legnagyobb hígításnak megfelelő állapotban az anti-Brigit szérum nem semlegesít és amelyek (AOS)IDSO faktora legalább azonos a Brigit-törzsével (ATCC VR786). 10 Ezeket a mintákat külön-külön 10-4 koncentrációra hígítjuk, majd SPF-tojásokon egyszer tenyésztjük. Az így kapott vírus-szuszpenziók egyikét, amely a B/Hong-Kong/8/73 törzs antigén-jellegével és he-15 magglutinin-hőérzékenységével rendelkezik, és amelynek EIDS o/(AOS)ID 5 o aránya azonos a Briget alaptörzsével, R 5 törzsnek neveztük el, és az American Type Culture Collection gyűjteményben ATCC VR787 számon helyeztük letétbe. 20 A 2. táblázatban az R 5 jelű rekombináns és az alaptörzsek (Brigit (ATCC VR786) és B/HK/8/73 (ATCC VR792) sajátságait hasonlítjuk össze egymással. 2. táblázat Törzs Szérum típus Brigit B/HK/8/73 EIDSO /(AOS)ID SO Hemagglutinin hőmérsékletérzékeny jellege Brigit B/HK/8/73 R5 + + + + + + Az esetlegesen jelenlevő szárnyas-eredetű kísérőanyagok eltávolítása céljából az R 5 jelű rekom- 40 binánst embriót tartalmazó SPF-tyúktoj ásókon két határhígítási lépésben tenyésztjük, majd egy további tenyésztési lépésben nagymennyiségű vírusanyagot képezünk. Az utóbbi lépésben kapott allantoisz-folyadékot összegyűjtjük, 5%-os koncent- 45 ráció eléréséig peptonnal elegyítjük, majd fagyasztva szárítjuk. készítményt kapunk. A terméket ezután fagyasztva szárítjuk, és a fiolákat leforrasztjuk vagy szorosan ledugaszoljuk. Az így kapott anyagot használjuk fel vakcina-alapanyagként. A vakcina beadása előtt egy fiola tartalmához 0,5 ml vizet, fiziológiás nátriumklorid-oldatot vagy 5%-os vizes szacharóz-oldatot adunk, és a kapott folyadékot az orrüregbe cseppentjük. 4. példa 50 Az 1. példában leírt módon előállított, fagyasztva szárított anyagot (azaz a Brigit törzset (ATCC VR786) használjuk fel kiindulási anyagként a nagyüzemi vakcinatermeléshez. A fagyasztva szá- 55 rított törzset embriót tartalmazó tyúktojások allantoisz-folyadékában egy lépésben tenyésztjük. A tojásokat 3 napon át 35 C°-on inkubáljuk. Az allantoisz-folyadékokat elkülönítjük, egye- 60 sítjük, megvizsgáljuk sterilitásukat és biztonságukat, majd 5% peptonkoncentráció eléréséig peptonnal elegyítjük. A kapott elegyet 3 ml-es üvegfiolákba osztjuk szét, így egy-egy dózisegységnek megfelelő (azaz legalább 10 EIDS0 mennyiségű) vírus- 6 $ A peptonnal elegyített allantoisz-folyadékokat nagyobb fiolákba is szétoszthatjuk, és így több dózisegységet tartalmazó készítményeket állíthatunk elő. Brigit-törzsből kapott legyengített. B-típusú influenza vírus-vakcinával végzett kezelés A klinikai kísérleteket 46 önként jelentkező, a kezelés előtt B-típusú influenza-vírussal szemben 32-es vagy annál kisebb Hl (hemagglutináció-gátló) faktorral rendelkező személyen végeztük. A kísérleti személyeknek 8 napos vagy 14 napos időközönként kétszer adtuk be a vakcinát. A fagyasztva szárított anyagot közvetlenül a beadás előtt elegyítettük 5%-os vizes szacharóz-oldattal, és a kísérleti személyek mindkét orrüregébe 5-5 csepp vakóinát 5
