170522. lajstromszámú szabadalom • Eljárás élő legyengített influenza-vírustörzsek és ezeket tartalmazó vírus-vakcinák előállítására
5 170522 6 Az R22 (ATCCVR 788) és az R 75 (ATCC VR 789) törzsek antigén sajátságának összehasonlítása R22 R75 5 Hemagglutinációs gátlási titer hörcsögön 10 Geometriai átlag titer Reakció (%) <8 < 8 <8 16 <8 8 <8 < 8 <8 < 8 0 1,4 0 40 15 Az R 22 (ATCC VR 788) törzs semmilyen Immorális reakciót nem váltott ki hörcsögökön, ezzel szemben az R 75 (ATCCVR 789) törzs 40%-os humorális reakciót váltott ki. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör 20 korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa 25 A B/Russia/69 influenza-vírustörzs (ATCC VR 790) mintáját tisztítás céljából specifikus patogénmenles (SPF) tojásokon három véghigításos tenyésztési lépésnek vetjük alá. Az utolsó lépésben 30 kapott vírusanyag mintáját használjuk fel a kísérleti célokhoz szükséges vírustömeg előállítására. A kapott vírustömeg szárnyas-kórokozóktól mentes, szérum-inhibitorokra érzékeny, és emberekkel szemben maradék patogén aktivitással rendelkezik. A kiin- 35 dulási vírus-anyagból normál nátriumklorid-oldattal különböző koncentrációjú (10-1 , 10~ 3 , 10~ 5 és 10"7 ) elegyeket készítünk, és ezeket az elegyeket hígítatlan, valamint nátriumklorid-oldattal 25%-osra, illetve 5%-osra hígított steril normál sertésszérum- 40 mai elegyítjük. A sertésszérum előkészítése során a szérumot 15 percig forrásban levő vízben tartjuk, majd homogenizáljuk, és 30 percig 2000 fordulat/perc sebesseggel centrifugáljuk. A vírus-szérum elegy készítéséhez az így kapott felső folyadék- 45 fázist használjuk fel. A vírus-szérum elegyeket 1 órán át 37 C -on inkubáljuk, majd a kapott elegy 0,2 ml-es mintáit előzetesen 8—11 napon át 37 C°-on keltetett, majd lámpázott embriót tartalmazó tyúktojások allantoisz-üregébe fecskén- 50 dezzük. A tenyésztéshez csak az élő embriókat tartalmazó tojásokat használjuk fel. Ezután a tojásokat 24-96 órán át tovább inkubáljuk. Az inkubálási idő lejártakor a tojásokat lámpázzuk, és az élő embriókat tartalmazó tqjá- 55 sokat 4C°-ra hűtjük. Minden egyes kísérletben elkülönítjük az élő embriókat tartalmazó tojások allantoisz-folyadékát, majd hemagglutinációs módszerrel meghatározzuk az influenza-vírus jelenlétét. A következő tenyésztési lépéshez a legnagyobb 60 vírus-hígítás (azaz legkisebb vírus-koncentráció) és legnagyobb szérum-koncentráció esetén kapott, még hemagglutinációs aktivitást mutató allantoisz-folyadékokból elkülönített mintát használjuk fel (ez esetünkben a 10"6 vírus-koncentrációval és 25%-os 65 szérum-hígítással kapott minta). A második tenyésztési lépést az előzővel teljesen azonos körümények között végezzük. A fenti módon összesen 5 tenyésztési lépést hajtunk végre. Az ötödik lépés után elkülönített, és a legnagyobb vírus hígítás (esetünkben 10"6 ) wés legnagyobb szérum-koncentráció (esetünkben hígítatlan szérum) fenntartásával végzett tenyésztési lépésből származó vírusok hemagglutinációs aktivitással rendelkeznek, és szérum-inhibitorokkal szemben rezisztensek. Ezután a kapott rezisztens mutáns klónozása és a rezisztens jelleg stabilitásának ellenőrzése céljából szérum távollétében három további véghigításos tenyésztési lépést végzünk. Az egyes tenyésztési lépések után elkülönített vírusok normál szérum-inhibitorokkal szemben teljes mértékben rezisztensek. Az utolsó tenyésztési lépésben kapott, Brigit nevű és ATCC VR786 letéti számú vírust használják fel a törzs elszaporításának és az oltóanyag előállításának inokulumaként. E célból az elkülönített allantoisz-folyadékokat összegyűjtjük, megvizsgáljuk sterilitásukat és biztonságukat, 5%-os peptontartalom eléréséig peptonnal elegyítjük, majd a kapott elegy 0,5 ml-es mintáit 3 ml-es ampullákba töltjük, és fagyasztva szárítjuk. így a Brigit törzs (ATCC VR786) oltóanyagát kapjuk. A módosított vírus (Brigit-törzs) in vitro és in vivo körülmények között meghatározott jellemzői: 1) Inhibitor-rezisztencia: A vírusoknak az 1 órán át 75 C°-on hőkezelt normál állati szérumokban jelenlevő inhibitorokkal szembeni rezisztenciáját a következőkben vizsgáljuk: A hőkezelt normál szérumból sorozathígítást készítünk (a sorozat egyes tagjait kétszeresre hígítjuk) és a sorozat egyes tagjait 4 hemagglutinációs egységnek megfelelő mennyiségű módosított vírussal, illetve alapvírussal elegyítjük. Az elegyet 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd csirke-vörösvérsejtekkei elegyítjük, és az eredményeket feljegyezzük. Vizsgálataink szerint az oltóanyag és az abból előállított további oltóanyagok teljes mértékben rezisztensek. Ezt a teljes mértékű rezisztenciát a továbbiakban „pozitív" eredményként értékeljük. 2) Antigén-hatás és mellékhatásmentesség vizsgálata: Két menyétet intranazális úton 107 — 108 EID50 mennyiségű Brigit vírustörzzsel (ATCC VR786) oltunk be, és 8 napon át naponta megmérjük az állatok végbél -hőmérsékletét. Jelentős hőmérsékletnövekedést nem észleltünk, az állatok maximális hőmérséklete 39,6 C° volt. Egy másik kísérletben két menyétet intranazálisan 107 - 10* EIDso mennyiségű B/Russia/69 alaptörzzsel (ATCC VR790) oltunk be, A beoltás után 2 nappal az állatok testhőmérséklete 40,2 C° volt. 3
