170428. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a pregnán-sor új szteroidjainak előállítására
5 170428 6 extrakt feldolgozása után D-homo-11/3,17aa-21-trihidroxi-pregna-1,4-dién-3,20-diont (D-homo-prednizolon) kapunk. Kitermelés: 60-80%. 3. példa Az 1. példában ismertetett eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy Curvularia lunata NRRL 2380 helyett Cunninghamella bainieri ATCC 9244 törzset tenyésztünk. 60 órás fermentációs idő után 11/3,17aa-21 -trihidroxi-D-homo-4-pregnén-3,20-diont kapunk, mely etilacetátos átkristályosítás után 245-246 C°-on olvad. e242 = 15200. 4. példa Az 1. példában ismertetett eljárás szerint Curvularia lunata NRRL 2380 törzset tenyésztünk. 900 ml előtenyészetet 50 literes kísérleti fermentorba viszünk át, melyben 30 liter, 1% kukoricalekvárt, 1% szójalisztet és 0,005% szójaolajat tartalmazó steril táptalaj van. Ezután 12 órán át 29 C°-on 30 liter/perc levegőztetés és 220 fordulat/perc kevertetés mellett 12 órán át növekedni hagyjuk, majd 6g 6a-fluor-D-homo-Reichstein-S-21--acetátnak 200 ml metilcelloszolwal képezett sterilre szűrt oldatát adjuk hozzá és fentiekkel azonos körülmények között folytatjuk a fermentációt. A fermentáció lefolyását időnként mintavétellel követjük nyomon, majd 68 óra múlva (52 órás érintkezési idő) megszakítjuk. A fermentlevet szűrjük, a szűrletet és a leszűrt micéliumot metil-izobutil-ketonnal extraháljuk. Az extraktumokat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A koncentrátumot szilikagélen kromatografáljuk. Az eluátum első részletei átalakulatlan és elszappanosított kiindulási anyagot tartalmaznak. A középső frakcióból 6a-fluor-llj3--17aa,21-trihidroxi-D-homo-pregnén-3,20-diont kapunk, mely etilacetátos átkristályosítás után 1,85 g tisztított terméket ad. Op.: 235-236 C°, e237 = 14300. 5. példa A 4. példában ismertetett eljárást azzal a. változtatással végezzük el, hogy Curvularia lunata NRRL 2380 törzs helyett azonos nevű NRRL 2178 sz. törzset alkalmazunk. 6. példa A 4. példában ismertetett eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy Curvularia lunata NRRL 2380 törzs helyett Cunninghamella bainieri ATCC 9244 törzset tenyésztünk. 7. példa A 4. példában ismertetett eljárást azzal a változtatással végezzük el, hogy Curvularia lunata 2380 törzs helyett Cunninghamella elegáns ATCC 9245 törzset alkalmazunk. 5 8. példa 2 literes Erlenmeyer lombikban 500 ml, 1,5% peptont, 1,2% kukoricalekvárt és 0,2% magnéziumszulfátot tartalmazó táptalajt sterilezünk, Bacillus 10 lentus ATCC 13805 törzs háromnapos ferde agar tenyészetével beoltjuk és 24 órán át 30 C°-on rázatjuk. A kapott előtenyészettel 50 literes rozsdamentes kísérleti fermentorban levő 30 liter, 121 C°-on és 1,1 att. nyomáson sterilezett, 0,2% 15 élesztőextraktot, 1% kukoricalekvárt és 0,1% keményítőcukrot tartalmazó, 7,0 pH-értékre beállított folyékony táptalajt beoltunk. A csíráztatást Silicon SH habzásgátló szer jelenlétében 29C°-on levegőztetés és keverés közben végezzük el. 6 órás növe-20 kedési időszak után 7,5 g 6a-fluor-ll/3,17aa,21-trihidroxi-D-homo-4-pregnén-3,20-dion és 150 ml dimetilformamid oldatát adjuk hozzá. A fermentációt 37 óra (31 órás érintkezési idő) után abbahagyjuk és a fermentlevet 2x10 ml metil-izobutil-ketonnal 25 extraháljuk. Az extraktumokat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot hexánnal mossuk és etilacetátból átkristályosítjuk. 4,4 g 6a-fluor-11/?,17aa,21-trihidroxi-D-homo-l ,4-pregnadién-3,20--diont kapunk. Op.: 265-267 C°, e238 = 15900. 9. példa Az 1. példában megadott körülmények között 35 Pellicularia filamentosa f. sp. sasakii ATCC 13289 törzset tenyésztünk és csíráztatunk. 900 ml előtenyészetet 20 literes üvegfermentorba viszünk át, melybe előzőleg 6% folyékony keményítőcukrot (3% glükóz), 1% kukoricalekvárt, 0,2% nátriumnit-40 rátot, 0,1% káliumdihidrogénfoszfátot, 0,2% dikáliumhidrogénfoszfátot, 0,05% magnéziumszulfátot, 0,002% ferroszulfátot és 0,05% káliumkloridot tartalmazó táptalajt rétegezünk. Ezután 12 órán át 29 C°-on 30 liter/perc levegőztetés és 220 fordu-45 lat/perc kevertetés mellett növekedni hagyjuk, majd 3 g 6a-metil-l 7aa,21-dihidroxi-D-homo-4-pregnén-3,20-dion-21-acetát és 100 ml dimetilformamid sterilre szűrt oldatát adjuk hozzá és azonos körülmények között továbbfermentáljuk. 17 órás fer-50 mentációs idő (35 óra érintkezési idő) után a fermentlevet szűrjük. A micéliumot és a fermentlevet metil-izobutil-ketonnal extraháljuk. Az extraktumokat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A maradékot hexánnal mossuk és szilikagélen kromatog-55 rafáljuk, 1 : 1 arányú metilénklorid-aceton eleggyel történő gradiens eluálással a kezdeti frakciókból 870 mg elszappanosított nyersterméket kapunk. A középső frakció etilacetát-izopropiléter elegyből történő átkristályosftása után 218—219 C?-on ol-60 vadó 133 mg 6a-metil-l 1/3,17aa,21-trihidroxi-D-homo-4-pregnén-3,20-diont kapunk. e242 = 15100. A további frakcióból izopropiléter-hexán elegyből történő átkristályosítás után 660 mg 6a-metil-1 lj8,17aa,21-trihidroxi-D-homo-4-pregnén-3,20-diont 65 kapunk. Op.: 184-186 C°, e242 = 15000. 3
