170428. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a pregnán-sor új szteroidjainak előállítására

3 mely (I) általános képletű D-homo-szteroidot (mely képletben R21 jelentése a fent megadott) valamely, az Arthrobacter genushoz — például A. simplex ATCC 6946, a Bacillus genushoz - például B. lentus ATCC 13805 és B. sphaericus ATCC 7055, 5 a Pseudomonas genushoz - például P. seruginosa IFO 3505, a Flavobacterium genushoz — például F. fiavenscens IFO 3058, a Lactobacillus genushoz - például L. brevis IFO 3345, vagy a Nocardia genushoz - például N. opaca ATCC 4276 - tar- 10 tozó mikroorganizmus vagy abból nyert enzim segítségével az 1,2-helyzetben dehidrogénezünk. Az eljárás a) változata szerint a hidroxilezést a 11-hidroxil-csoportnak szteroidokba mikrobiológiai 15 úton történő bevitelére önmagában ismert módszerekkel [Charney-Herzog: Microbial Transformation of Steroids, (1967), 230-1. oldal] végezhetjük el. A 11-hidroxilezéshez a Fungi és Schizomycetes taxonómiai egységekbe tartozó mikroorganizmuso- 20 kat, előnyösen az Ascomycetes, Phycomycetes, Basidiomycetes és Actinomycetales alegységekbe tartozó mikroorganizmusokat alkalmazhatunk. A mikroorganizmusokból kémiai úton (pl. nitrites kezeléssel) vagy fizikai módszerekkel (pl. besugárzás- 25 sal) előállított mutánsok, továbbá a mikroorganizmusokból kapott sejtmentes enzim-készítmények is felhasználhatók. Az eljárás b) változata szerint az (I) általános 30 képletű D-homo-szteroidok 1,2-dehidrálását önmagában ismert módon, mikrobiológiai úton végezhetjük el [Charney-Herzog: Microbial Transformation of Steroids, (1967), 236. oldal]. Az 1,2-dehidrogénezéshez pl. Schizomycetákat alkalmazhatunk. 35 Az (I) általános képletű D-homo-szteroidok endokrin különösen gyulladásgátló hatássaPrendelkeznek. Patkányon a „filz tesztben" a granulómaképződés 40%-os gátlása érhető el az alábbi hatóanyag- 40 dózisokkal: 2,7 mg/kg llj3,17aa,21-trihidroxi-pregn--4-én-3,20-dion, 0,9 mg/kg llj3,17aa,21-trihidroxi-pregna- 45 -1,4-dién-3,20-dion, 0,35 mg/kg 110,17aa,21-trihidroxi-9a-fluor-pregn-4-én-3,20-dion, 0,05 mg/kg 110,17aa,21-trihidroxi-9a-fluer-pregna-l,4-dién-3,20-dion. 50 A „filz-teszt" leírása a következő: Válltájékban a bőr alá vatta-golyócskákat ültetünk be. Az állatokat négy nap múlva leöljük, a képződő granulómát eltávolítjuk, szárítjuk és lemérjük. A granuló- 55 maképzés csökkentése jelenti a teszt-vegyület gyulladásgátló hatásának mértékét. A teszt-vegyület a beültetés napjával kezdődően naponta kétszer adagolandó. 60 Az (I) általános képletű vegyületeket és 1,2-dehidro-származékaikat a gyógyászatban a hatóanyagot és enterális, perkutan vagy parenterális adagolásra alkalmas, szerves vagy szervetlen, iners hordozóanyagokat tartalmazó készítmények alakjában alkal- 65 4 mázhatjuk. Hordozóanyagként pl. vizet, zselatint, gumi arabicumot, tejcukrot, keményítőt, magnéziumsztearátot, talkumot, növényi olajokat, polialkilénglikolokat, vazelint stb. alkalmazhatunk. A gyógyászati készítményeket szilárd (pl. tabletta, drazsé, kúp, kapszula), félszilárd (pl. kenőcs) vagy folyékony (pl. oldat, szuszpenzió vagy emulzió) alakban állíthatjuk elő. A készítmények adott esetben sterilezhetők és/vagy segédanyagokat (pl. konzerváló-, stabilizáló-, nedvesítő- vagy emulgeálószereket, az ozmózisnyomás változását előidéző sókat vagy puffereket) és gyógyászatilag értékes más vegyületeket is tartalmazhatnak. Az eljárás további részleteit a példákban ismertetjük anélkül, hogy a találmányt a példákra korlátoznánk. 1. példa 5,0% glükózt, 0,5% kukoricalekvárt, 0,2% nátriumnitrátot, 0,1% káliumdihidrogénfoszfátot, 0,05% káliumkloridot, 0,05% magnéziumszulfátot, 0,002% vas(II)szulfátot tartalmazó 500 ml steril táptalajt Curvularia lunata (NRRL 2380) kéthetes ferde agar tenyészetével beoltunk és 5 napon át 30 C°-on rázatunk. A kapott előtenyészét tel 20 literes előformentorban levő, 15 liter steril táptalajt oltunk be, mely 5,0% keményítőcukrot, 0,25% kukoricalekvárt, 0,1% nátriumnitrátot, 0,05% káliumdihidrogénfoszfátot, 0,025% káliumkloridot, 0,025% magnéziumszulfátot és 0,001% vasszulfátot tartalmaz. Az előtenyészetet 72 órán át keverés (220 fordulat percenként) és levegőztetés (15 liter levegő percenként) közben 29C°-on növekedni hagyjuk. 900 ml ily módon kapott előtenyészetet 20 literes főfermentorba viszünk át, mely 14,1 liter, az előfermentorban levővel azonos összetételű táptalajt tartalmaz. A tenyészetet keverés és levegőztetés közben 24 órán át 29 C°-on fejlődni hagyjuk, majd 3,0 g 17a -hidroxi-21 -acetoxi-D-homo-4-pregnén-3,20-dionnak (op.: 249-251 C°) 150 ml dimetilformamiddal képezett, sterilre szűrt oldatát adjuk hozzá és a fermentációt további 40 órán át folytatjuk. A fermentlevet leszűrjük, a szűrletet és a micéliumot metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, az extraktumokat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. A kapott maradékot kovasavgél-oszlopon kromatografáljuk. A kapott nyersterméket aceton és hexán elegyéből átkristályosítjuk. A kapott termék a 11/3, 17a-dihidroxi-21-acetoxi-D-homo-4-pregnén-3,20-0-dion. Kitermelés: 50-70%. 2. példa 0,15% kukoricalekvárt, 0,5% peptont és 0,5% glükózt tartalmazó, desztillált vízzel készült táptalajt pH = 7,3 értéken Arthrobacter simplex ATCC 6946 törzzsel beoltunk. A tenyészetet 28 C°-on 24 órán át növekedni hagyjuk, majd 25 mg D-homo-hidrokortizonnak 1 ml 80%-os vizes etanollal képezett oldatát adjuk hozzá. 48—72 órás inkubációs időszak után a micéliumot a szubsztrátumtól elválasztjuk, vízzel mossuk, majd a mosóvizet és a szubsztrátumot metilénkloriddal extraháljuk. Az 2