170340. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek előállítására N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximid alkalmazásával

5 170340 6 kel reakcióba lépő szabad N-termális aminocsoportot tartalmazó aminosavak vagy peptidek C-terminális karboxilcsoportja védett csoport lehet. Ami a védőcsoportokat illeti, az egyes funkcionális csoportok védésére alkalmas csoportok általánosan ismertek, az ismeretek a találmány szerinti eljárásban felhasználhatók. Az N-terminális aminocsoportok védésére előnyösen használható jellemző csoportokról az előzőekben már szó volt. Más aminocsoportokat, például karbobenzoxi-, t-amiloxikarbonil-, t-butiloxikarbonil-, izoborniloxikarbonil-, p-nitrofenilszulfinil-, p-nitrokarbobenzoxi-, p-klórkarbobenzoxi-, p-metoxikarbobenzoxi-, formil- vagy difenilmetiloxikarbonilcsoporttal védhetünk. A karboxilcsoportot egyszerű észterképző csoporttal, például metil-, etil-, butil-, t-butil-, benzil-, p-metoxibenzil-, t-amil-, fenil- vagy p-nitrobenzil-csoporttal védhetjük. A fenti csoportokon kívül egyes polimerizált gyanták, például polihidroximetilsztirol is használható mint védőcsoport. A szulfidcsoportok védelmére tioésztercsoportokat képző csoportokat, például benzil- vagy p-metoxibenzilcsoportot használunk, továbbá tiokarbonilcsoportokat is kialakíthatunk, például benzoil-, t-butiloxikarbonilvagy karbobenzoxi csoporttal stb. A hidroxilcsoportot általában benziléter- vagy t-butiléter-csoporttal védjük, bár bizonyos esetekben O-acil-csoportokkal, például acetil- vagy benzoilcsoporttal stb. is szubsztituálhatunk. Az arginin w-quanidilcsoportját, nemcsak karbobenzoxi- vagy izoborniloxikarbonilcsoporttal hanem nitro- vagy tozilcsoporttal is védhetjük. A védett N-terminális aminocsoporttal rendelkező aminosav vagy peptid N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximidészterének egy móljára vonatkoztatva általában előnyösen egy mól szabad N-terminális aminocsoporttal rendelkező aminosavat, peptidet, vagy ezek egy reakcióképes származékát adagolunk, de az arány adott esetben növelhető vagy csökkenthető. A találmány szerinti eljárás során a reakciót a fehérjeszintézisekkor általánosan használt oldószerekben végezzük. így többek között használhatunk vizet, étert, etilacetátot,.acetont, ketonokat, dioxánt, tetrahidrofuránt, kloroformot, diklórmetánt, diklóretánt, széntetrakloridot, dimetilacetamidot, dim etilformamidot, piridint, dimetilszulfoxidot, foszforsavat, trisz(dietil)-amidot, acetonitrilí, N-metilpirrolidont stb., továbbá ezek elegyeit. A reakciót általában -20 Cü és 50 C°, előnyösen -5 C° és 30 C° közötti hőmérsékleten végezzük. A reakcióidő 30 perc és 48 óra között változik. A reakció lejátszódása után, ha az előállított fehérje vízben gyengén oldódik, előnyösen úgy járunk el, hogy a reakcióelegyet vízzel, híg vizes ammóniaoldattal, híg vizes nátrium-hidrogén-karbonáttal vagy kálium-karbonát vizes oldatával hígítva kicsapjuk a terméket. Ha a termék, az előállított fehérje szerves oldószerekben gyengén oldódik, úgy szerves oldószer, például etilacetát, alkohol, aceton, kloroform stb. adagolásával kicsapjuk azt a reakció elegyből, ügy is eljárhatunk, hogy a terméket elkülönítés nélkül további reakciónak vetjük alá. Az N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximid az oldatból visszanyerhető. A találmány szerinti eljárás kivitelezésére természetesen úgy is eljárhatunk, hogy egyetlen reakcióedénybe adagoljuk az összes reagenst, azaz a védett N-terminális aminocsoporttal rendelkező aminosavat vagy peptidet, az N-hidroxi-5-norbornén-2,3-karboximidet, a karbodiimidszármazékot és a szabad N-terminális aminocsoportot tartalmazó aminosavat, peptidet vagy ezek származékát. Ebben az esetben 5 először a szabad N-terminális aminocsoporttal rendelkező aminosav vagy peptid reagál a karbodiimid jelenlétében az N-hidroxi-5-norbornén-2.3-dikarboximiddel, majd a keletkezett, védett N-terminális aminocsoporttal rendelkező aminosav vagy peptid N-hidr-10 oxi-5-norbornén-2,3-dikarboximidésztere reagál a szabad aminocsoporttal rendelkező aminosavval, pepiiddel vagy ezek származékával. Ilyen körülmények között a peptidlánc felépítése egy lépésben következik be. A reakciókomponensek arányát az előzőek 15 szerint választjuk meg, a reakcióidő, a reakcióelegy hőmérséklete és a termék elkülönítése szintén a fentiekkel azonos, illetve a fentiek szerint történik. Az előzőekből nyilvánvaló, hogy a reakciótermékként keletkező peptidmolekula általában egy vagy 20 több, a funkcionális csoportokat, például az amino-, karboxil-, hidroxilcsoportot stb. védő védőcsoportokat tartalmaz. Ezeket a csoportokat adott esetben hasíthatjuk. A védőcsoportok eltávolításának módszerei a peptidszintézissel foglalkozó szakemberek 25 körében jól ismertek. A találmány szerinti eljárás során ezek az eljárások (például hidrogénfluoridos trifluorecetsavas vagy hidrogénbromid -ecetsav eleggyel való kezelés, vagy palládium katalizátor jelenlétében történő redukció) szintén felhasznál-30 hatók a védőcsoportok eltávolítására. A találmány szerinti eljárással különböző peptideket, bármennyi számú és bármilyen fajta aminosavrészből álló fehérjemolekulákat előállíthatunk. A találmány szerinti eljárással terápiás szempontból ér-35 tékes tulajdonságú peptideket, például oxitocint, vassopreszcint, glukagont, ACTH-t (adrenokortikotrop hormon), továbbá ezek analógjait, szekretint, kalcitonint, inzulint, gasztrint, bradikinint, eledoizint, LH-RH-t (luteinizáló hormont - „releasing" (felsza-40 badító) hormont), ciklikus, peptid típusú antibiotikumokat (például penicillin, cefalosporin), továbbá ezek származékait, TRH-t (tirotropint szabaddá tevő hormon), MIF-t (melanocita stimuláló hormont gátló faktor) stb., továbbá a fenti peptidek előállításakor 45 köztes termékként számításba jövő vegyületeket is előállíthatunk. A találmány szerinti eljárás leglényegesebb előnyei a következők: a reakció során nem keletkeznek racém módosulatok, továbbá az N-hidroxiszukcinimid hasz-50 nálatakor elkerülhetetlen mellékreakciók nem következnek be; az előállítani kívánt peptid jó kitermeléssel keletkezik és különíthető el; a peptid előállítására a reakciót vizes oldatban végezhetjük, ugyanis az illető, védett N-terminális aminocsoporttal rendelkező ami-55 nosav vagy peptid N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximid észt ere állandó vegyület és nem hidrolizál, ami majdnem elképzelhetetlen az ismert N-hidroximidészterek esetében. Fentieken kívül a találmány szerinti eljárás előnye, hogy az előállított fehérje igen tisztán 60 különíthető el, ugyanis a peptidkötés kialakulása után felszabaduló N-hidroxi-5-norbornén-2,3-dikarboximid könnyen és teljes mértékben eltávolítható a reakcióelegyből. Ez azért lehetséges, mert vízben jól oldódik és ugyancsak jól oldódik a fehérjeszintézisekkor 65 általánosan használt oldószerekben. Megjegyezzük, 3