170269. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(béta-fenoxi-acetamido-3-alkil- cef-3-em-4-karbonsavak N-dezacilezésére

3 170269 4 logy 7. kiadása értelmében Erwinia aroideae-nek nevezett mikroorganizmus sejtszuszpenziójával, amely reakcióval egyidejűleg végbemegy a képződött 6-amino-2,2-dimetil-penám-3-karbonsav újraacileződése is. Meglepő módon azt találtuk, hogy a 7{ß-fenoxi- 5 acetamido>3-alkil-cef-3-em-4-karbonsavak N-dezacilezhetők az enyhén savas pH-tartományba eső egyik optimális pH-értéken a képződött 7ß-amino-3-alkilcef-3-em4-karbonsavak lényeges újraacileződése nélkül a Bergey's Manual of Determinative Bacteriology !0 8. kiadása értelmében Erwinia carotovora-nak (ugyanezen könyv 7. kiadása értelmében Erwinia aroideaenek) nevezett specieshez tartozó valamelyik törzs által termelt sejtmentes enzim alkalmazásával. A sejtmentes anyag alkalmazása esetében megfelelő ho- ^ zamok elérése érdekében azt is megállapítottuk, hogy a sejtmentes, oldatba vitt enzimet stabilizálni szükséges az N-dezacilezés foganatosítása alatt az enzim hatásosságának fenntartására. Szakember számára érthető, hogy általában cél- 20 szerű a 7-(ß-fenoxi-acetamido)-3-alkil-cef-3-em4-karbonsavak N-dezacilezését semleges vagy enyhén savas pH-értéken foganatosítani a /3-laktámgyűrű felhasadásának meggátlására, szemben a gombák termelte enzimek esetében alkalmazott 10 körüli pH-értékek- 25 kel. A fentiek alapján tehát a találmány tárgya eljárás 7-(ß-fenoxi-acetamido)-3-alkil-cef-3-em4-karbonsavak N-dezacilezésére. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy valamely 7-(/3-fenoxi-acetamido)-3-alkil-cef-3- 30 em-4-karbonsavat egy, az Erwinia carotovora, illetve - az előbb említettekre tekintettel - Erwinia aroideae specieshez tartozó törzs, előnyösen az Erwinia aroideae ATCC-25206 törzs által termelt, sejtektől, továbbá /3-laktamázoktól és visszaacileződést elősegítő 35 enzimektől mentes amidohidroláz enzim hatásának teszünk ki adott esetben aktivátor jelenlétében, 3,5 és 6,5 közötti pH-értéken, és az enzim oldatát vas(II)ionokkal stabilizáljuk. Az így kapott 7j3-amino-3-alkilcef-3-em-4-karbonsavat ezután extrahálás útján el- 40 különítjük. A kiindulási anyagként használt 7-(j3-fenoxi-acetamido)-3-alkil-cef-3-em-4-karbonsavak - ahol az alkilcsoport 1—14 szénatomos lehet - az 1 361 183 és 1 444 224 számú nagy-britanniai szabadalmi leírások- 45 ban ismertetett módon állíthatók elő. Az említett specieshez tartozó baktériumok sejtmentes extraktumainak előállítása során a sejtek ismert módon tárolhatók és oltóanyagok ugyancsak 50 ismert módon készíthetők. A sejtek ugyanakkor ismert módon tenyészthetők valamilyen hagyományos táptalajban, azaz nitrogén-, szén-, hidrogén-, oxigén-, foszfor- és kénforrást, valamint ásványi anyagokat tartalmazó vízben, amelynek* pH-értékét még az inku- 55 bálás előtt beállítjuk. A táptalajt tartalmazó palackot ezután megfelelő időn át inkubáljuk forgatás közben, majd a sejteket a tenyészetből elkülönítjük, például centrifugálás útján és elroncsolásuk előtt mossuk. A sejteket ezután valmilyen pufferben szuszpendálhat- 60 juk, ezt követően pedig elroncsoljuk ultrahangos kezeléssel vagy őrlés útján, például üveggyöngyökkel végzett őrlést alkalmazva. Az elroncsolt sejteket ezután elkülönítjük centrifugálás útján, amikor is felülúszó fázisként az amidohidrolázt tartalmazó extraktu-, 65 mot kapjuk. Az extraktum ezután kívánt esetben ismert módszerekkel tovább tisztítható. Azt találtuk továbbá, hogy rendkívül lényeges az enzim stabilizálása vas(II)-ionokkal. A sejtmentes enzim ugyanis lényeges mértékben veszít aktivitásából az N-dezacilezés alatt, ha a reakcióelegy nem tartalmaz vas(II)-ionokat. Érdemes megjegyezni, hogy csak a vas(II)-ionok tűnnek alkalmasnak erre a célra. Sőt azt is meg szükséges jegyeznünk, hogy meglehetősen szokatlan amidohidrolázok vas(II)-ionokkal végzett stabilizálása. A vas(II)-ionokat a sejtek elroncsolása előtt vagy után adagoljuk, célszerűen valamilyen vízoldható, nem kelát jellegű vas(II)-só, például vas(II)szulfát vagy vas(II)-ammónium-szulfát alakjában. A vas(II)-ionokat előnyösen 0,1-1,0 mmól, különösen előnyösen mintegy 0,2 mmól koncentrációban alkalmazzuk. A vas(II)-ionok beadagolásának optimális időpontját egyszerű kísérletezés útján állapítjuk meg, azonban mindig tekintetbe kell vennünk, hogy a vas(II)-ionok beadagolása után az oldat pH-értékét 6,5-nél kisebb értéken tartsuk annak érdekében, hogy az enzim működésére gátló hatást kifejtő vas(III)ionok képződését minimalizáljuk. Az enzim aktivitása növelhető, ha az enzim oldatához valamilyen aktivátort, például valamilyen tiolt, azaz például ditiotreitolt(l,2-ditio-3,4-dihidroxi-n-bután, l,3-ditio-2,4-dihidroxi-n-bután, 2,3-ditio-l,4-dihidroxi-n-bután és 1,4-ditio-2,3-dihidroxi-n-bután elegye), ditioeritritet, /knerkapto-etanolt, ciszteint, glutationt (7-L-glutamil-L-ciszteinil-glicin) vagy liponsavat (például liponsav-lítiumsó formájában) vagy aszkorbinsavat adunk. Az aminohidroláz enzim enzimaktivitása úgy határozható meg, hogy ismert mennyiségű szubsztrátum és enzim keverékét inkubáljuk a reakciónak leginkább kedvező pH-értéken, majd a fermentlét feldolgozzuk és a képződött 7ß-amino-3-alkil-cef-3-em4-karbonsavat elkülönítjük, ezt követően pedig meghatározzuk. Egy aktivitásegységen az enzimnek azt a mennyiségét értjük, amely képes meghatározott körülmények között percenként 1 /umól szubsztrátumot hidrolizálni. Kísérleteink során azt találtuk, hogy az Erwinia aroideae baktériumból nyert fermentlé 1 ml-je mintegy 5 egységnyi enzimet ad. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja értelmében a 7-(0-fenoxi-acetamido)-3-metil-cef-4-karbonsav inkubálható 37 °C-on 2 órán át az Erwinia aroideae baktérium által termelt amidohidrolázzal 4,5 és 6,5, előnyösen 5,0 és 6,0 közötti pH-értéken. A reakcióelegy kívánt pH-értéken tartása, vagyis pufferolása például egy szerves sav alkálifémsójának, így például nátrium-acetátnak vagy 3,3,-dimetilglutársav-káliumsónak alkalmazásával érhető el. A reakcióelegyet ezután alkalmas módon feldolgozhatjuk, például 100 °C-on 5 percen át végzett hevítés és ezt követően a reakcióelegy lehűtése, vagy pedig jéggel végzett kifagyasztás útján. Az így koagulálódott fehérjéket ezután centrifugálás útján elkülönítjük és a felülúszó folyadékfázist betöményítjük. A kapott tömény oldatot ezután előnyösen egy erősen bázikus, kvaterner ammóniumcsoportokat hordozó anioncserélő gyantát tartalmazó oszlopra (például acetátionokkal töltött Dow ex-1 márkanevű gyantával töltött oszlopra) visszük fel, majd a terméket eluálószerrel, például ammónium-acetát vizes oldatával eluáljuk. 2