170269. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(béta-fenoxi-acetamido-3-alkil- cef-3-em-4-karbonsavak N-dezacilezésére
5 170269 6 Az így kapott, 7ß-amino-3-metil-cef-3-emJcarbonsavat tartalmazó eluátumot ezután szárazra pároljuk, majd a maradékot vízben feloldjuk. A vizes oldat pH-ját ezután vizes savoldattal, előnyösen vizes sósavoldattal a kicsapandó termék izoelektromos pontjára, azaz 3,5-re beállítjuk, amikor is a 7/3-amino-3-metilcef-3-em-4-karbonsav kicsapódik. A csapadékot ezután kiszűrjük és mossuk, például acetonnal. Alternatív módon a 7/3-amino-3-metil-cef-em-4-karbonsavat kicsaphatjuk közvetlenül az eluátumból, ha annak pH-ját az izoelektromos pontra beállítjuk. Megállapítottuk, hogy a 7j3-amino-3-metil-cef-3-em4-karbonsav nem gátolja jelentős mértékben az Erwinia aroideae által termelt enzim működését annak optimális pH-ján. A katalizálni kívánt reakció foganatosítására szolgáló reakcióelegyhez hozzáadhatjuk közvetlenül az enzim vizes oldatát is. Hozzáadható a reakcióelegyhez az enzim szilárd formában is, például ha fagyasztásos szárítással különítettük el. Az enzim felhasználható továbbá „rögzített" formában alkalmas mátrixban vagy mátrixon. Ilyen enzimkészítmények közül megemlíthetjük például az olyan készítményeket, ahol az enzim zárványszerűen mátrixhoz, például valamilyen üveghez vagy mesterséges úton előállított polimerhez, például rostos cellulóz-triacetáthoz kötött, vagy pedig az enzim oldhatatlanná van téve a membránon. Ilyen rögzített enzimkészítményeket ismertetnek többek között az 1 224 947 számú nagy-britanniai vagy a 782 646 számú belga szabadalmi leírásban. Bár a szabad enzim vizes oldatokban leginkább 3,5-6,5 pH-értékeken hatásos, ugyanakkor azt találtuk, hogy amennyiben az enzim alkalmas mátrixban vagy mátrixon rögzített, akkor alkalmazásakor a reakcióelegy pH-értéke valamivel magasabb, azaz körülbelül 7-8 pH-értékű lehet. Az alábbiakban az amidohidroláz enzimaktivitásának meghatározására alkalmas módszert ismertetünk. Ez a módszer lényegében azonos a találmány szerinti módszerrel. Egy aktivitás egység alatt az enzimnek az a mennyisége értendő, amely percenként 1 /umól 7-(|3-fenoxi-acetamido)-3-metil-cef-3-em4-karbonsavat hidrolizál az alábbi körülmények között: 20 fimól 7-(ß-fenoxi-acetamido)-3-metil-cef-3-em4-karbonsavat, 15 f/mól ecetsavat (amelynek pH-ját nátrium-hidroxiddal 5-re beállítottuk), 50 /imól vas(II)-szulfátot, 3 jumól ditiotreitet és enzimet tartalmazó, összesen 0,25 ml térfogatú oldatot 37 °C-on inkubálunk 15 percen át, majd az inkubálást 100 °C-on 5 percen át végzett forralással megszakítjuk. A képződött csapadékot ezután centrifugális útján elkülönítjük, majd a felülúszó folyadékfázishoz 0,5 ml 1 mólos ecetsavoldatot adunk és az így kapott elegyet 2,5 X 0,6 cm méretű, Dowex 1X8 márkanevű anioncserélő gyantával (acetátionokkal töltött állapotban) töltött oszlopra felvisszük (az anioncserélő gyanta szemcsemérete 200-400 mesh). A hidrolízis útján képződött 7j3-amino-3-metil-cef-3-em4-karbonsavat 5 ml 1 mólos ecetsavoldattal eluáljuk. A kapott eluátum teljes mennyiségét 6 ml-re kiegészítjük 1 mólos ecetsavoldattal, majd a 7ß-amino-3-metil-cef-3-em4-karbonsav mennyiségét az így kapott oldat 260 nm-en mérhető abszorpciójából állapítjuk meg. E vegyület moláris extinkciós koefficiense 260 nm-en 1 mólos ecetsavoldatban 7,6 X 103 liter • mól "' • cm _1 . A találmány szerinti eljárás előnye egyszerűsége és egyszerűségéből következő gazdaságossága. Kémiai módszerek, így például foszfor(V)-oxid alkalmazása esetében elkerülhetetlen a 4-helyzetű karboxilcsoport 5 védelme, míg a találmány szerinti enzimatikus eljárás esetében a dezacüezés elvégezhető szabad savon, vagyis nincs szükség külön műveleti lépésként védőcsoport kialakítására, illetve kívánt esetben utólagos lehasítására. Továbbá a kémiai módszerek alkalmazása esetén 10 általában specifikus reagensek és reakciókörülmények biztosítása szükséges, valamint - minthogy ezek a módszerek több műveleti lépésből állnak - a reakcióparamétereket rendkívül pontosan szükséges szabályozni, és legtöbbször alacsony hőmérsékleten szüksé-15 ges dolgozni. A kémiai módszerek esetében ugyanakkor igen nagy a veszélye annak, hogy az érzékeny j3-laktámgyűrű bomlást szenved. A találmány szerinti eljárás esetében egyetlen lépést kell végrehajtani könnyen beszerezhető reagensekkel anélkül, hogy a 20 reakcióparaméterek szigorú szabályozása szükséges lenne. Ez az előny fokozott mértékben jelentkezik, ha immobilizált enzimet használunk a dezacilezéshez. Továbbá az enzimatikus dezacilezésre a /Maktámgyűrű sokkal kevésbé érzékeny; a reakcióelegy feldolgozása 25 is rendkívül egyszerű annak következtében, hogy nincsenek kémiai úton képződött melléktermékek. Végül további előnyként említhetjük, hogy az enzimatikus reakció végbemenetelének kedvező pH-tartományban a 'ß-laktamgyuru különösen kevéssé érzé-30 kény bomlásra. A találmányt közelebbről az alábbi példákkal kívánjuk megvilágítani. 1. példa 35 7-j3-Amino-3-metil-cef-3-em4-karbonsav előállítása a) Erwinia aroideae baktériumot (NRRL B—138, ATCC-25206) tenyésztünk 250 ml-es, pH 7,3-ra beállított 50 ml táptalajt tartalmazó rázólombikban egy 24 órás törzstenyészetből vett 1%-os oltóanyagot 40 használva. A táptalaj 1 literje 5 g peptont (gyártó cége az Evans Medical Co. Ltd cég), 3 g nátrium-kloridot, 20 g szacharózt, 8 g Oxid márkanevű anyagot (gyártó cége a Lab. Lemco) és 5 g Oxid-élesztőkivonatot tartalmaz. A rázólombikokat 28 °C-on 40 órán át 45 inkubáljuk, miközben 220 fordulat/perc sebességgel rázatjuk őket. A tenyészet 5 literjének sejtjeit ezután centrifugálás útján elkülönítjük és 6,8 pH-jú 0,05 mólos foszfát-pufferrel mossuk. A sejteket ezután 6,8 pH-jú 0,05 mólos foszfát-pufferrel mossuk. A sejteket 50 ezután 6,8 pH-jú 0,05 mólos foszfát-puffer 500 ml-ében (a puffer még 0,2 nmól vas(II)-szulfátot és 5 nmól ß-merkapto-etanolt is tartalmaz) szuszpendáljuk, majd ultrahangos kezeléssel elroncsoljuk. A sejtmaradványokat centrifugálás útján elkülönít-55 jük, és a felülúszó fázishoz olyan mennyiségben adunk cetil-trimetil-ammónium-bromidot, hogy annak végső koncentrációja 1% legyen. Az ekkor képződött csapadékot centrifugálás útján elkülönítjük, majd a felülúszó fázishoz annyi vas(II)-szulfátot adunk, hogy 60 végső koncentrációja a felülúszó fázisban 2 mmól legyen. Az így kapott oldat pH-ját ezután ecetsavval 4,5-re állítjuk be. Az ekkor kicsapódó fehérjéket centrifugálás útján elkülönítjük, majd a kapott felülúszó folyadékfázist 0,2 mmól vas(II)-szulfátot és 5 65 mmól /3-merkapto-etanolt tartalmazó 50 mmól-os ace-3
