170264. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az S-adenozil-L-metionin szulfonsavsóinak előállítására
170264 5 6 kapott keveréket még 1 óra és 2 óra közötti időn át, előnyösen másfél órán át állni hagyjuk. Megjegyzendő, hogy az élesztőgomba sejtjeinek híg kénsavoldat és etil-acetát elegyével végzett bontása jóval kedvezőbb, mint például a szobahőmérsékleten perklórsawal vagy a 60 °C-on hangyasawal vagy ecetsavval végzett hagyományos módszerek, nemcsak azért, mert szobahőmérsékleten végezhető (amely hőmérséklet rendkívül kedvező a SAM stabilitása szempontjából), hanem azért is, mert olyan körülmények között végezhető, hogy a kapott keverékből a sejtmaradékok könnyen kiszűrhetők és az így kapott szűrlet mentes azoktól a szennyeződésektől, amelyek jelen vannak az említett más sejtbontó anyagok alkalmazása esetén és amelyek igen nehezen távolíthatók el a tiszta SAM előállítására eddig ismert módszerekkel. A kiindulási SAM-Oldat előállítására egy további alternatíva abban áll, hogy a SAM-ot enzimatikus szintézis útján, éspedig ATP-t és metionint tartalmazó keverékből inkubálás közben az ATP-metionin-adenoziltranszferáz nevű enzimet (E.C. 2.4.2.12) alkalmazva állítjuk elő. E módszer ipari kivitelezhetőségének alapvető feltétele az, hogy egyrészt az enzim tiszta, másrészt mind a kiindulási keveréktől, mind pedig a képződött SAM-tól könnyen elkülöníthető legyen. Kidolgoztunk egy módszert az ATP-metionin-adenoziltranszferáz enzim tisztítására, mely tisztítást affinitáson alapuló kromatográfia útján végezzük. Az így tisztított enzim megfelel az előző bekezdésben említett követelményeknek, továbbá a későbbiekben ismertetendő módon SAM-nak oszlopban végzett reagáltatás útján történő előállításához hasznosítható. Az említett enzim affinitáson alapuló kromatografálásos tisztítása tehát abban áll, hogy az enzimet tartalmazó oldatot (például egy élesztőgomba vagy Escherichia coli mikroorganizmus sejtjeinek nyers extraktumát) olyan oszlopon bocsátjuk át, amely olyan szilárd hordozóval van töltve, melyhez az enzimmel szemben inhibitáló hatású csoport, illetve vegyület van kovalensen kötve. Meglepő módon azt találtuk ugyanis, hogy egy ilyen oszlophoz kiváló töltetként alkalmazható olyan, poliszacharidból álló aktivált gél, amelyhez L-lizin van kovalensen kötve. Az enzimek a szilárd mátrixhoz kötött lizin-maradékkal szemben mutatott affinitása az enzim eluálódásának elhúzódását eredményezi, így az enzim a többi fehérjétől igen tiszta állapotban elkülöníthető. Az ezután következő enzimatikus szintézis céljaira az enzimnek az eluátumból való elkülönítése azonban teljes mértékben elégtelen eredményekhez vezet, minthogy az őt tartalmazó eluátumból való elkülönítése után az enzim stabilitása rohamosan csökken. Sőt, további nehézséget jelent, ha az enzimet egyszer felhasználjuk SÀM szintézisben, a SAM elkülönítése során az enzim elroncsolódik. Kutatásaink során arra a felismerésre jutottunk, hogy kiváló eredmények érhetők el, ha az enzimet tartalmazó eluátumból az enzimet megfelelő szilárd hordozón adszorbeáljuk, majd a hordozóval töltött oszlopban végezzük el a metionin és az ATP katalitikus reagáltatását. E célra alkalmas hordozók a fehérjék szilárd hordozóhoz kötésére alkalmas reagensekkel, például brómciánnal aktivált poliszacharidok. Ha tehát ATP-t és metionint megfelelő pufferoldatban oldva átbocsátunk az enzim eluátumával előzetesen kezelt oszlopon, akkor SAM-ot tartalmazó eluátum hagyja el az oszlopot. A találmány szerinti eljárás (1) lépése lehetővé 5 teszi a SAM igen tiszta állapotban történő elkülönítését. Savas közegben ugyanis a pikrolonsav által kicsapott egyetlen vegyület a SAM, mint azt az Anal. Biochem., 4, 16—28 (1971) irodalmi helyen ismertetettek értelmében elvégzett vékonyréteg-kromatog-10 ráfiás vizsgálatok bizonyították. A pikrolonsav tehát meglepő módon nagyon szelektív kicsapószernek bizonyul. A SAM kicsapására eddig alkalmazott kicsapószerek, így például a pikrinsav, Reinecke-só vagy a bórsav rendkívül szennyezett csapadékot adnak, úgy 15 hogy ezeket a csapadékokat a SAM tisztítása céljából további tisztítási műveleteknek kell alávetni, így például ioncserélős oszlopkromatografálásnak, mely rendkívül költséges ipari méretekben nehezen megvalósítható művelet. További hátrányuk az eddig alkal-20 mázott kicsapó szereknek, hogy alkalmazásukkor rendkívül nehéz megfelelő tisztaságú SAM előállítása. A pikrolonsav vizes oldatainak vagy a korábban már említett szerves oldószerekkel alkotott oldatainak alkalmazása semmiféle technikai nehézséget nem 25 jelent és maga a művelet szobahőmérsékleten végezhető. A találmány szerinti eljárás (2) lépésében használt oldatokban a SAM pikrolonsawal alkotott sójának lebomlása tökéletes, azaz a szilárd anyag tökéletesen 30 oldódik. A találmány szerinti eljárás (3) lépése szerinti kicsapást előnyösen az előző lépésben kapott oldat térfogatára vonatkoztatva négyszeres és tízszeres közötti mennyiségű oldószerrel, éspedig célszerűen ben-35 zol, toluol, dietil-éter, diizopropil-éter, aceton, metilizobutil-keton, metil-acetát, etü-acetát és tetrahidrofurán közül valamelyikkel végezzük. Miként említettük, a találmány értelmében a SAM kettős sói úgy is előállíthatók, hogy egy, a (3) lépés 40 szerint előállított kettős sót újra oldjuk a benne levő szulfonsavra és kénsavra nézve egyaránt 0,05 és.0,2 közötti normalitású, valamely 1—4 szénatomos alkanollal vagy (1—4 szénatomos)-alkoxi-(l—4 szénatomos)-alkanollal készült oldatban, majd ezután az így 45 kapott oldatból a kettős sót az oldáshoz használt alkohollal tökéletesen elegyedő szerves oldószerrel újra kicsapjuk. Vizsgálataink szerint ha a kettős sq oldásához szükséges minimális mennyiségű alkoholos oldatot használunk, akkor az ezután következő kicsa-50 csapolási lépésben SAM+ • HS0 4 "• H 2 S0 4 . • 2 RS03 H általános képletű kettős sók - ahol R jelentése a korábban felsorolt szulfonsavak molekulájában a szulfonsavcsoporttól éltérő rész — képződnek. Ha viszont a kettős só újraoldásához minimálisan 55 szükséges alkoholos oldat térfogatánál legalább kétszer nagyobb térfogatú alkoholos oldatot használunk, akkor az ezután következő kicsapási lépésben SAM + • HSO4 - -H2 S0 4 • RSO3H általános képletű kettős sók - ahol R jelentése a fenti — képződnek. 60 A találmány szerinti eljárással kapott egyszerű SAM-sók és a SAM kettős sói egyaránt száraz állapotban korlátlan ideig tárolhatók a SAM bomlása nélkül. A találmányt közelebbről az alábbi kiviteli példák-65 kai kívánjuk megvilágítani. 3
