170227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-ribóz előállítására
170227 5 6 100-3000 Mg/1 tiamin-hidrokloridot és 100 //g/ml sikiminsavat tartalmaz. A beoltott táptalajt rázás közben 32-37 C°-on 24 óra hosszat inkubáljuk. A kapott tenyészlét centrifugaijukba sejtek összegyűjtése végett, amelyeket a 0,001 M merkaptoetanolt tartalmazó 0,01 M trisz-(hidroximetil)-aminometán-HCl pufferoldattal kétszer átmosunk, és ugyanilyen pufferoldaltban újraszuszpendáljuk. Ily módon olyan sejtszuszpenziót kapunk, amelynek abszorpcióképessége 650 nm-nél 10. Ezutáns íojásfehérje-lizozimet adunk a szuszpenzióhoz 50 //g/ml lizozimkoncentráció eléréséig és miután a reakciót 37 C°-on 30-90 percig hagyjuk végbemenni, a rendszert centrifugáljuk. A kapott felülúszó folyadék az előbb említett (A) sejt-extraktum. (II) (B) sejt-extraktum készítése Egy táptalajt, amely 0,5% szorbitot, 0,65% nátrium L-glutamátot, 0,1% KH2 P0 4 -et, 0,3% K 2 HP0 4 ot, 0,1% Na2 S0 4 -et, 0,01% MgS0 4 -7H 2 0-t, 0,004% biotint, 0,0003% tiamin-hidrokloridot és 0,01% sikiminsavat tartalmaz, beoltunk artnak a törzsnek ferde tenyészetével, amelynek 2-dezoxi-D-glukóz oxidációs aktivitását meg akarjuk határozni, és a tenyészetet rázás közben 37 C°-on 20 óra hosszat inkubáljuk. A tenyészléből centrifugálással vonjuk ki a sejteket, amelyeket 0,001 M merkaptoetanolt tartalmazó 0,01 M triszhidroximetil)-aminometán-HCl pufferoldattal kétszer átmosunk, majd ugyanilyen pufferoldatban szuszpendálunk. Ily módon olyan sejtszuszpenziót kapunk, amelynek abszorpcióképessége 650 nm-nél 100. A szuszpenziót ultrahangos roncsoló val (Insonater, Kubota Iron Works Ltd., Japán) kezeljük 160 Hz-nél 10 percig, ezáltal a sejtek széttöredeznek. Az üledéket centrifugálással távolítjuk el. A fölülúszó frakció a (B) sejt-extraktum. A leírásban a nagy 2-dezoxi-D-glukóz-oxidáz aktivitás azt jelenti, hogy amikor a (B) sejt-extraktumra vonatkozóan — amelynek készítését alább írjuk lemérjük a nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD ) redukciójának mennyiségét a szintén később leírt 2-dezoxi-D-glukóz-oxidáz aktivitás reakcióoldatának felhasználásával és az említett mennyiségre vonatkoztatva kiszámítjuk az említett extraktum enzimatikus aktivitását a leírt képlet segítségével, a kapott érték nem kevesebb, mint 0,05 //mól/perc/protein mg, de nem több, mint 1,00 //mól/perc/protein mg. (III) A transzketoláz aktivitás mérése A reakcióoldat (1,11 ml): 20 //mól D-ribóz-5-foszfát, 0,5 //mól NADH, elegendő mennyiségű D-ribóz-5-foszfát-ketoizomeráz és epimeráz, elegendő mennyiségű triózfoszfát-izomerázt tartalmazó 0,66 egység a-glicerofoszfát-dehidrogenáz, 0,43 //mól tiamin- pirofoszfát és 40 //mól trisz(hidroximetil)-aminometán-HCl pufferoldat (pH= =7,5). B reakcióoldat (0,89 ml): 20 //mól MgCl2 , 0,43//mól tiamin pirofoszfát, 40 //mól trisz(hidroximetil)-aminometán-HCl pufferoldat (pH=7,5) és 10) //l enzimoldat. Mindegyik reakcióoldatot 30 C°-on 10 percig inkubáljuk, majd a reakcióoldatokat összekeverjük (a teljes térfogat 2 ml). Az abszorpcióképesség változást 340 nm-nél 30: C°-on Gilford 2000-es többmintás abszorpcióképesség-mérővel mérjük (Gilford Multiple Sample Absorbance Recorder 2000, Gilford Instrument Laboratories Inc., USA). (IV) Az epimeráz aktivitás mérése A reakcióoldat (0,9 ml): 5 20 //mól D-ribóz-5-foszfát, 20 //mól MgCl2 0,43 //mól tiamin-pirofoszfát, elegendő mennyiségű transzketoláz^ és 40 //mól trisz(hidroximetil)-aminometán-HC1 pufferoldat (pH=7,5). B reakcióoldat (1,09 ml): 10 0,5 jumól NADH, 0,66 egység a-glicerofoszfát-dehidrogenáz, amely elegendő mennyiségű triozfoszfátizomerázt tartalmaz, elegendő D-ribóz-5-foszfát-ketoizomeráz és transzketoláz és 60 //mól trisz(hidroximetil)-aminometán-HCl pufferoldat (pH=7,5). 15 Az A reakcióoldatot 30 C°-on 30 percig, a B reakcióoldatot pedig 30 C°-on 10 percig inkubáljuk. A reakcióoldatot összekeverjük, majd 10 //l enzimoldatot adunk a keverékhez (a teljes térfogat 20 ml). Az abszorpcióképesség-változást 340 nm-nél 20 ugyanolyan módon mérjük, mint a transzketoláz esetében. (V) A 2-dezoxi-D-glukóz-oxidáz aktivitási próba reakcióoldata. 1,2 ml 1 M trisz(hidroximetil)-aminometán-HCl 25 pufferoldat (pH=8,0), 0,2 ml 0,1 mM MnS04-4-6H2 0, 0,2 ml 20 mM NAD, 0,2 ml 1 M 2-dezoxi-D-glukóz és 0,2 ml (B) sejtextraktum (reakcióhőmérséklet 30 C°). (VI) Enzimaktivitás számítása 30 Az enzim oldatban az enzimaktivitást a következő képlettel írjuk le: 35 ahol — AE340 /perc az összekevert reakcióoldat nettó abszorpcióképessége csökkenésének sebessége 340 nm-nél, 1 percre vonatkoztatva, V az összekevert reakcióoldat teljes térfogata (2 ml), Saz NADH 40 molekuláris extinkciós együtthatója 340 nm-nél (6,22 cm2 ) (//mól), d a fény útja (1 cm), E az enzimoldat térfogata (0,01 ml), és p a protein súlya az enzimoldatban (mg/ml). A találmány szerinti eljárásban olyan Bacillus 45 pumilus vagy Bacillus subtüis törzset alkalmazunk, amely a transzketoláz és epimeráz közül legalább az egyiket nem tartalmazza, és a magas 2-dezoxi-D-glukóz-oxidáz aktivitás és az asporogén tulajdonság közül legalább az egyikkel rendelkezik. Ezek a tör-50 zsek oly módon állíthatók elő, hogy az eredeti törzseket ultraibolya fénnyel, röntgensugárral, gammasugárral vagy hasonló sugárzásokkal sugározzuk be, vagy az eredeti törzseket kémiai mutagének, így N-metil-N'-nitro-N-nitrozoguanidin, nitrogénmustár, 55 dimetilszulfoxid, etilmetánszulfonát stb. hatásának tesszük ki. Természetesen lehetséges olyan törzseket kapnunk, amelyek nem tartalmazzák a transzketoláz és epimeráz közül legalább az egyiket, és további mutációra késztethetjük a törzset, hogy az asporogén 60 tulajdonság és magas 2-dezoxi-D-glukóz oxidációs aktivitás közül legalább az egyikkel rendelkezzék, vagy megfordíthatjuk az eljárást, hogy a kívánt mutánst kapjuk. A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkal-65 mázható törzsek: 3
