170227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás D-ribóz előállítására
170227 7 8 Bacillus pumilus No. 911 (IFO 13 566), No. 1027 (IFO 13 585) és No. 1083 (IFO 13 620), és a Bacillus subtilis No. 957 (IFO 13 565), No. 941 (IFO 13 573), No. 1054 (IFO 13 586), No. 1067 (IFO 13 588), valamint No. 1097 (IFO 13 621). Az IFO betűket követő számok a deponálási számokat jelentik az osakai (Japán) Fermentációs Intézetnél. Ami a táptalajban használt tápanyagokat illeti, a találmány szerinti eljárásban a szénforrások: D-glukóz, D-Fruktóz, D-mannóz, szorbit, D-mannit, szacharóz, melasz,, keményítő-hidrolizátumok, keményítő, ecetsav és etanol. A nitrogénforrások lehetnek szerves nitrogénfonások, így kukoricalekvár, gyapotmaghulladék, élesztőkivonat, szárított élesztő, halliszt, húskivonat, pepton, kazaminosav stb; szervetlen nitrogénvegyületek, így vizes ammónia, ammóniagáz, ammóniumszulfát, ammóniurnnitrát, ammómumklorid, ammóniumkarbonát, ammóniumfoszfát, nátriumnitrát stb. valamint szerves nitrogénvegyületek, így karbamid, aminosavak stb. Az említett szén- és nitrogénfonásokon kívül a táptalaj tartalmaz különféle fémeket, vitaminokat, aminosavakat és egyéb olyan anyagokat, amelyek alapvetően szükségesek a szóban forgó mikroorganizmusok szaporodásához, és amelyek aránya optimális. A tenyésztést aerob módon végezzük, például rázott kultúrával. Az inkubáció hőmérséklete általában a 20 °C és 45 °C közti tartományban van, attól függően, hogy a szóban forgó mikroorganizmus növekedéséhez és a D-ribóz akkumulálásához milyen hőmérséklet a legmegfelelőbb. A táptalaj pH-ja előnyösen körülbelül 5 és 9 érték között van. A pH-nak az egész tenyésztési periódus alatt az optimális tartományban való tartása céljából időről időre neutralizáló anyagot adagolhatunk, így sósavat, kénsavat, vizes ammóniát, ammóniagázt, nátriumhidroxid vizes oldatát, kalciumkarbonátot, oltott meszet stb. A táptalajban körülbelül 2-5 nap alatt gyűlik össze elegendő mennyiségű D-ribóz. Az ily módon összegyűjtött D-ribózt könnyen eltávolíthatjuk, például a következő eljárással: a tenyészlét először megszűrjük vagy centrifugáljuk, ezáltal könyen eltávolíthatjuk a sejteket. Ezután a szűrletet aktív szenes és ioncserélő gyantás kezeléssel sómentesítjük és színtelenítjük, majd koncentráljuk. A koncentrátumhoz szerves oldószert, így etanolt adunk, ekkor a D-ribóz kristályok kiválnak. Akár ezt, akár más módszert alkalmazunk, a D-ribóz könnyen izolálható. Az alább következő példák a találmány szerinti eljárást illusztrálják; természetesen nyilvánvaló, hogy az eljárás alkalmazhatósága nem korlátozódik csak ezekre a példákra. A leírásban a százalékok súly/térfogat százalékot jelentenek, hacsak másként külön nem említjük. 1. példa Egy transzketolázt nem tartalmazó, asporogén Bacillus pumilus No. 911 mutánssal (IFO 13 566), amelyet ultraibolya fénnyel való besugárzással Bacillus pumilus IFO 12 113-ból állítottunk elő (transzketoláz aktivitás nem nagyobb, mint 0,01 /imól/perc/ protein mg; spóraképzési szaporaság 2X10-8), 10 ml táptalajt beoltunk, amely táptalaj 2,0% szorbitot, (Wako Pure Chem. Ind. Ltd.), kukoricalekvárt (Com Products Inc). 0,3% kálium-hidrogénfoszfátot, 0,1% kálium- dihidrogénfoszfátot, 100 Mg/ml tirozint (Wako) és 100 j/g/ml fenüalinint (Wako) tartalmaz. A 5 beoltott táptalajt 36 °C-on 24 óra hosszat inkubáljuk. A kapott kultúra terjes mennyiségét 100 ml táptalajhoz adjuk, amely 15,0% D-glukózt (Tokai Togyo Co., Ltd.), 1,0% szárított keményítőt (Kanegafuchi Chem. Ind. Ltd.), 0,5% ammómumszulfátot, 2,0% kalcium-10 karbonátot, 50 jig/ml triptofánt (Wako), 50 jug/ml tirozint és 50 Mg/ml fenilalinint tartalmaz, amelyben 36 °C-on 60 óra hosszat tenyésztjük; ezután a D-ribóz 64 mg/ml koncentrációban van jelen. Ebből a D-ribóz tenyészléből a sejteket szűréssel eltávolítjuk és a 15 szűrletet eredeti térfogatának felére koncentráljuk. Ezután körülbelül negyedrész térfogatnyi etanolt adunk hozzá, és a csapadékot szűrjük. A szűrletet 10 1 hidrogén-ciklusú IR 120 ioncserélővel (JAPAN Organo Co. Ltd.), majd 20 1 hidroxil-20 ciklusú Amberlite 4B ioncserélővel (JAPAN Organo Co. Ltd.) töltött oszlopon engedjük keresztül, a kationok, illetve az anionok eltávolítására. Ezután a folyadékot 10 1 aktív szénnel (kromatográfiai tisztaságú, Takeda Chem. Ind. Ltd.) töltött oszlopon 25 szűrve színtelenítjük. Az elfolyó oldatot bepároljuk, majd 4x-es mennyiségű etanol hozzáadásával kikristályosítva 5,0 kg kristályos D-ribózt kapunk. A kristályok IR-abszorpciós spektruma teljes egészében megegyezett a D-ribóz standard mintáéval (opecial grade, 30 Wako Pure Chem. Ind. Ltd.). Az elemanalízis a következő értékeket adta: számított: C: 40,00, H: 6,71 ; talált: C: 39,93, H: 6,90. 35 2. példa Egy transzketolázt nem tartalmazó asporogén Bacillus subtilis No. 957 mutánst (IFO 13 565), amelyet N-metil-N'-nitro-N-rútrozoguanidinnel való kezeléssel Bacillus subtilis IFO 3026-ból állítottunk elő (transz-40 ketoláz-aktivitás nem nagyobb, mint 0,01 jumol/perc/ protein mg; spóraképződési szaporaság 8X 10~ 5) az 1. példában leírt módon tenyésztve a tenyészlében 62 mg/ml-es koncentrációban van jelen a D-ribóz. Ebből a tenyészléből 4,6 kg kristályos D-ribózt kapunk 45 ugyanolyan módon, mint ahogyan az 1. példában leírtuk. 3. példa Egy epimerázt nem tartalmazó asporogén Bacillus 50 subtilis No. 941 mutánst (IFO 13 573), amelyet Bacülus subtilis IFO 3026-ból állítottunk elő, ultraibolya sugárral való besugárzással (epimeráz aktivitás nem nagyobb, mint 0,01 jumól/perc/protein mg;spóraképződési szaporaság 7X10-6 (az 1. példában 55 leírtak szerint tenyésztünk, ekkor a tenyészlében a D-ribóz 65 mg/ml koncentrációban van jelen. Ebből a tenyészléből 4,3 kg D-ribóz kristályt kapunk, az 1. példában leírt módon. 60 4. példa Transzketolázt nem tartalmazó és magas 2-dezoxi-D-glukóz-oxidáz-aktivitással rendelkező Bacülus pumilus No. 1027 mutánst (transzketoláz aktivitás nem nagyobb, mint 0,01 jumól/perc/protein mg; 2-dezoxi-65 D-glukóz oxidációs aktivitás 0,28 jumól/perc/protein 4
