170225. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pepszinosztreptin proteáz- inhibitorok előállítására

170225 15 16 keletkező, körülbelül 1 100 000 térfogatrész mennyiségű kultúrát az alábbi módon kezeltük, hogy a P-pepszinosztreptint kristályos alakban kapjuk. Á kultúrát először szűrőprésen, szűrő segédanyagként diatómaföldet használva szűrjük és a keletkező szűrletet 300 000 térfogatrész etil-acetáttal kezeljük. Az etü-acetátos fázist eldobjuk és a vizes fázist körülbelül 850 000 térfogatrészre betöményítjük, pH-ját sósavval 4,0 értékre beállítjuk és 100 000 térfogatrész aktív szenet tartalmazó oszlopon (Shirasagi, Takeda Chemical Industries) bocsátjuk keresztül, ekkor az aktív frakció megkötődik. Az oszlopot először 200 000 térfogatrész vízzel, majd 300 000 térfogatrész 40%-os vizes metanollal mossuk és az aktív frakciót 500 000 térfogatrész metanollal leoldjuk. Az eluátumot betöményítjük, így 600 súlyrész port kapunk, amely P-pepszinosztreptint tartalmaz. Ennek a pornak 50 térfogatrész mennyiségét 3000 térfogatrész 0,05 n nátrium-hidroxid-metanol (55:45) elegyben feloldjuk, pH-ját 10-re beállítjuk, majd az oldatot 44 000 térfogatrész makromolekulám adszorbenst, például Amberlite XAD-2 (Rohm et Haas), amelynek szemcsemérete 100-200 mesh, adszorbenst tartalmazó oszlopon bocsátjuk át, amelynek átmérőmagasság aránya 1:7. Az aktív frakciót összesen 200 000 térfogatrész 0,05 n nátriumhidroxid-metanol (55:45) és 0,05 n nátrium-hidroxid-metanol (35:65) eleggyel eluáljuk lineáris gradiens rendszer alakjában. Az első 80 000 térfogatrész mennyiségű frakciót eldobjuk és az azt követő 40 000 térfogatrész frak-10 dót, amely P-pepszinosztreptint tartalmaz, összegyűjtjük, pH-ját sósavval 3-ra beállítjuk, majd 2000 térfogatrész aktív szenet tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot vízzel és 40%-os vizes metanollal mossuk, majd a P-pepszinosztreptint metanollal eluáljuk. Az eluátumot szárazra pároljuk, így körülbelül 28 súlyrész fehér színű port kapunk. Ezt a port forró metanolban feloldjuk, majd az oldatot állni hagyjuk, így 25 súlyrész P-pepszinosztreptint kapunk fehér színű tűk alakjában, olvadáspont: 210-211 C°, elemzési eredmények: C 57,58%, H 9,06% és N 10,51%. 7. példa 15 200 térfogatrész térfogatú lombikban levő, 5% dextrint, 3% szójalisztet, 0,7% peptont, 0,5% kalcium-karbonátot, 0,05% ferroszulfátot, 0,05% mangán-szulfátot, 0,05% magnézium-szulfátot és 0,05% dikálium-hidrogén-foszfátot tartalmazó 7,0 pH-értékű 20 folyékony táptalajt (30 térfogatrész) Streptomyces ramulosus IFO 12 812 és Streptomyces citricolor Ferm-P-No. 393(ATCC 21 925) törzsekkel inokulálunk. Az inokuláció után azonnal vagy pedig a termelés során a táptalajhoz adjuk a nátrium-izo-25 butirát 7,0 pH-értékű 25%-os oldatát, a beoltott táptalajt rotációs rázógépen 4 napon át inkubáljuk 28 C -on. Ezután a 2. példában ismertetett módon egymástól függetlenül meghatározzuk a keletkező táptalajban a pepszinosztreptin és pepszinosztreptin-30 metilészter mennyiségét. A kapott eredményeket az alábbi 8. táblázatban adjuk meg. Mikroorganizmus 8.táblázat Nátriumizobutirát adagolásának hatása a pepszinosztreptin és pepszinosztreptin-metilészter felhalmozódására Nátriumizobutirát adagolá- Felhalmozódott sának módja Pepszinosztreptin Pepszinosztreptin -metil -(mg/ml) észter (rrig/ml) Streptomyces ramulosus nincs adagolás 0,11 IFO12 812(ISP-5100) 0,5% 0 h-kor 0,43 0,5% 18 h-kor 0,48 0,5% 0 h-kor és 0,59 1,0% 18 h-kor (összesen 1,5%) Streptomyces citricolor nincs adagolás 0,0072 0,0019 Ferm-P-No. 393 (ATCC) 0,5% 0 h-kor 0,036 0,0074 0,5% 18 h-kor 0,031 0,0087 0,5% 0 h-kor és 0,042 0,0093 1,0% 18 h-kor 8. példa 200 térfogatrész térfogatú lombikban levő 30 térfogatrész, 3% glükózt, 2% kukoricalekvárt, 0,05% dikáhum-hidrogén-foszfátot, 0,02% ammónium-szulfátot, 0,05% magnézium-szulfátot és 0,5% kalciumkarbonátot tartalmazó, 7,0 pH-értékű folyékony táptalajt Streptomyces citricolor Ferm-P-No.393 (ATCC 21 925) törzzsel inokulálunk. Az inokulált táptalajt 2 napon át 28 C°-on inkubáljuk, majd 2000 térfogatrész térfogatú, 500 térfogatrész fenti összetételű táptalajt tartalmazó lombikba visszük át és további 2 napon át inkubáljuk 28 C°-on. A keletkező táptalajt 50 000 térfogatrész térfogatú, 1% glükózt, 3% peptont, 0,7% húskivo-60 natot, 0,3% nátrium-kloridot, 0,2% dikálium-hidrogén-foszfátot és 0,5% nátrium-propionátot (ez 0,39% propionsavnak felel meg) tartalmazó, 7,0 pH-értékű folyékony táptalajt tartalmazó fermentorba visszük át. 65 Ezután hozzáadunk körülbelül 20 súlyrész habzás-8