170093. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás L-lizin előállítására

5 170093 6 répamelasz 3o g /melasz.szénhidráttartalma 5o súly #/ kukorica-extraktum 2o g /kukorica-extraktum szárazanyagtartalma 5o súly i>l nátriumklorid 4 g csapviz 1 liter torfogatig a táptalaj pH értéke 7,0-7,2. Az oltó-táptalajt előzőleg 4o percen át sterilizáltuk 12o-122 C° hőmérsékleten. Az oltó-táptalajt és 'törzssejteket tartalmazó lombikokat 24ö fordulat/perc mozgású rázóasztalra helyezzük és a tenyésztést 18-2o órán át folytatjuk 29-3o C° hőmérsékleten. Ezután a lombik tartalmát 2 térfogat % mennyiségben átvisszük egy 2o liter térfogatú munkafermentorba, amely levegőztetővel, turbókeverővel és a pH automatikus szabályozására szolgáló berendezéssel van felszerelve. Ez a fermentor az alábbi összetételű, előzőleg sterilizált fermentációs táptalajt tartalmazza: répamelasz 2,6 kg /melasz szénhidráttartalma 5o súly <£/ ásványolaj eredetű szénhidrogéneken tenyésztett Candida tropicalis hidrolizátuma 1,6 liter /12o g, száraz kiindulási élesztőre számitva/ ammóniumszulfát 36o g lecsapott kréta 24o g osapviz 12 liter térfogatig, a táptalaj pH értéke 7,1-7,3. A Candida tropicalis hidrolizátumát az alábbi módon állitottuk elő. 12o g száraz élesztőt 12oo ml 5 n kénsavban szuszpendáltuk. A hidrolízist 3 órán át végeztük autoklávban 129-131 C° hőmérsékleten. Ezután a hidrolizátumot szobahőmérsékletre hűtöttük és 4oo ml 25 $-os vizes ammónia-oldattal addig semlegesítettük, amig a pH el nem érte a 7,1-7,3 értéket, igy egyidejűleg megkaptuk a táptalaj második alkotórészét, a megadott mennyiségű ammóniumszulfátot. A semlegesített hidrolizátumot használtuk fel a fermentációs táptalaj előállításához. Az előirt összetételű fermentációs táptalaj sterilizálását fermentorban végeztük, oly módon, hogy a táptalajt 126-128 C°-ra melegítettük, majd egy órán át ezen a hőmérsékleten tartottuk. Az L-lizint termelő törzset az alábbi módon inokuláijuK: fermentorba bevezetett levegőmennyiség 1 perc alatt 1 térfogat táptalajra számitva 1 térfogatrész turbókeverő fordulatszáma looo/fordulat/perc levegőztetés intenzitása /szulfit-eljárás szerint/ 4,8 g Op/liter óránként inokulációs hőmérséklet 28-3o C°. 86 óra múlva a folyékony kultúra 35,8 g/liter L-lizint tartalmaz /L-lizin-monoklórhidrátban kifejezve/, ami a fermentációs táptalaj kezdeti szénhidrát-tartalmára vonatkoztatva 34,4 #-nak felel meg. Az L-lizin mellett a folyékony kultúra kis mennyiségű valint /1,6 mg/ml/ és izoleucint /1,8 mg/ml/ tartalmaz. Az eljárás befejezése után az L-lizint elkülönítjük a folyékony kultúrából. Ennek során a törzs biomasszáját centrifuga /3ooo fordulat/perc, 3o perc/ vagy szeparátor segítségével választjuk el a folyékony kultúrától. A biomassza elválasztása után kapott nativ oldatot kationcserélő gyantát tartalmazó oszlopon vezetjük át. A megkötött L-lizint vizes ammónia-oldattal eluáljuk és az eluátumot bepároljuk, ekkor az ammóniát a vizgőzzel eltávolítjuk. A kapott koncentrátumot sósavval 3,8-4,0 pH-érték eléréséig savanyitjuk és etanollal kezeljük. 32o g kristályos L-llzln-monoklórhidrátot kapunk. 2. példa L-lizin bioszintéziséhez homoszerin-, izoleucin- és valin-hiányos Micrococcus glutamieus T-3 törzset használunk /deponálva B-39 számon a WNIIGENETIKA Intézetben/. Az inokulum tenyésztésének, a törzs inokulálásának /fermentációs táptalaj, levegőztetés intenzitása, hőmérséklet/ és az L-lizin elkülönítésének a körülményei megegyeznek az 1.példában megadott körülményekkel. 5 86 óra múlva a folyékony kultúra 39,6 g/liter L-lizint tartalmaz /L-lizin-monoklórhidrátban kifejezve/, ez a fermentációs táptalaj kezdeti szénhidráttartalmára vonatkoztatva 38,1 %nak felel meg. A folyékony kultúra nem tartalmaz izoleucint és valint. 10 3. példa L-lizin bioszintézisére homoszerin-, Izoleucin- és valin-hiányos Micrococcus glutamicus T-3 türzset használunk. Az inokulumot az 1. példában leirt módon tenyésztjük, majd az L-lizin bioszintéziséhez 3 térfogat jí mennyiségben munkafermentorba visz-15 szűk át. A fermentor az alábbi összetételű, előzőleg sterilizált fermentációs táptalajt tartalmazza: répamelasz 3 kg /melasz szénhidráttartalma 5o súly i>l 9(-> ásványolaj eredetű széhhidrogéneken tenyésztett Candida tropicalis hidrolizátuma 1 liter /loo g,száraz kiindulási élesztőre számitva/ ammóniumklorid 36o g 25 csapviz 12 liter térfogatig a táptalaj pH-értéke 7,1-7,3. A Candida tropicalis hidrolizátumát az alábbi módon állitjuk elő. loo g száraz élesztőt 7oo ml 6 n kénsavban szuszpendálunk. A hidrolizist 3 órán át végezzük autoklávban 131-132 C° _n hőmérsékleten. Ezután a hidrolizátumot szoba-JU hőmérsékletre hűtjük és pH-ját vizes báriumhidroxid-szuszpenzió hozzáadásával 7,1-7,3-ra állitjuk be. A lecsapott báriumszulfát csapadékot kiszűrjük és a szürletet használjuk fel a fermentációs táptalaj alkotórészeként. A törzset a megadott összetételű táptalajon 35 az 1.példában leirt körülmények között inokuláljuk. 86 óra múlva a folyékony kultúra 43,8 g/liter L-lizint tartalmaz /L-lizin-monoklórhidrátban kifejezve/, ami a fermentációs táptalaj kezdeti szénhidráttartalmára vonatkoztatva ' 35,3 $-nak felel meg. A folyékony kultúra nem tartalmaz más aminosavakat. 40 A bioszintézis befejezése után az L-lizint az 1. példában leirt módon különitjük el a folyékony kultúrából. 4. példa L-lizin előállítására homoszerin-hiányos Micrococcus glutamicus 95 törzset használunk. 4t- Az inokulumot az

1.példa szerinti módon te^ö

nyésztjük, majd 2 térfogat # mennyiségben munkaf ermentorba visszük át, amely az 1.példa szerinti fermentációs táptalajt tartalmazza. Az első napon a törzset 7oo fordulat/perc fordulatszámú keveréssel és óránként 3 _g Op/llter levegőztetési intenzitással tenyésztjük 28-3o 50 C°-on. A második naptól kezdve az eljárás befejezéséig a tenyésztést looo fordulatszám/perc fordulatszámú keveréssel és óránként 4,8 Oo/liter levegőztetési intenzitással folytatjuk 33-35 C°-on. Az eljárás folyamán egy perc alatt a fermentációs táptalaj egy térfogatára számiti-(- va 1 térfogatrész levegőt vezetünk be a fermen-00 torba. 74 óra múlva a folyékony kultúra 38,4 g/liter L-lizint tartalmaz /L-lizin-monoklórhidrátban kifejezve/, ami a fermentációs táptalaj kezdeti szénhidráttartalmára vonatkoztatva 36,9 %nak felel meg. Az L-lizint mellett a folyékony 60 kultúra 1,4 g/liter valint és l,o g/liter izoleucint tartalmaz. Az L-lizint az 1.példa szerinti módon különítjük el a folyékony kultúrából. ' 5. példa L-lizin előállításához homoszerin-, izoleu„_ cin- és valin-hiányos Micrococcus glutamicus ob T-3 törzset használunk. Az inokulumot az 1.példa szerinti módon tenyésztjük, majd az L-lizin bioszintéziséhez 4 3