170093. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás L-lizin előállítására

3 170093 4 az élesztőt Asp.oryze gombákbél önmagában ismert módon kinyert litikus enzimekkel kezeljük. A litikus enzimek kinyerésének módját a "Takarmányélesztők fermentativ hidrolizátumai - bakteriológiai táptalajok alapanyagai" oimü, Intézetünk kiadásában Moszkvában 1971-ben megjelent disszertációban ismertettük. Az élesztő fenti enzimekkel való kezelését o előnyösen 26-45 °C-on és 5,o-6,o pH-értéken végezzük, az élesztő súlyára vonatkoztatva célszerűen 1,6 96 litikus enzimet használva. Az említett hidrolízises eljárások közül /savas és fermentációs hidrolizis/ a savas hidrolízis az előnyösebb. -JQ Az L-lizin előállítására irányuló találmány szerinti eljárás hatékonyságának növelésére nézve előnyös, ha a törzset 28-3o °C-on tenyésztjük 24-3o órán át, miközben a levegőztetés intenzitása óránként 3-4 g Oo/liter, majd a termelést 5o-56 órán át folytatjuk 33-35 Ö

C-on, miközben a levegőztetés intenzitása órán- 15 ként 4,8-6 g 02

/Hter. Azáltal, hogy a tenyésztést különböző hőmérsékleten és eltérő levegőztetés! intenzitással végezzük, amelynek során figyelembe veszszük, hogy a törzs fejlődésének különböző szakaszaiban eltérő hőmérsékletet és levegőt i- j~ gényel, lerövidíthető az L-lizin bioszintézi- zu sének időtartama és csökkenthető az egységnyi termékre eső elektromos energia felhasználás. A találmány szerinti eljárást az alábbi módon valósítjuk meg. Homoszerin-hiányos, például Miorococcus glutamicus 95 törzset vagy homoszerin-, izo- 25 leucin- és valin-hiányos, például Micrococcus glutamicus T-3 törzset és homoszerin-hiányos Brevibacterium Sp., például Brevibacterium sp. 22 törzset ferde agar-táptalajon 18-24 6-rán át tenyésztünk '28-3o C° hőmérsékleten. Ezután a törzs sejtjeit fiziológiás oldattal mossuk és lombikba vagy fermentorba visszük ^U át. A lombikban vagy fermentorban előzőleg sterilizált olyan oltó-táptalaj van, amely szénhidrátokat, például melaszt, szacharózt, glükózt vagy maltózt, növekedést serkentő anyagokat, például kukoricaextraktumot, élesztőextraktumot, peptont vagy kazein-hidroli- 35 zátumot és ásványi sókat, például nátriumkloridot, káliumfoszfátot tartalmaz. A törzs tenyésztését minő a lombikban, mind a fermentorban 18-24 órán át végezzük 28-3o C° hőmérsékleten, Az inokulumot ezután 2-5 térfogat^ mennyiségben munka-fermentorba visszük át, amelyben előzőleg steri- 40 lizált olyan fermentációs táptalaj van, amely szénhidrátokat, például melaszt, szacharózt vagy glükózt, nitrogén forrásként ammóniumBÓkat, például ammóniumszulfátot vagy ammóniumkloridot vagy pedig karbamidot és a törzs növekedéséhez szükséges aminosav- 45 és vitaminforrást, mégpedig ásványolaj eredetű szénhidrogéneken termelt Candida élesztő hidrolizátumot vagy i-lizint termelő törzs biomasszájának a találmány értelmében előállított hidrolizátumát tartalmazza. A fentiekben felsorolt alkotórészeken kivül a fermentációs táptalaj tartalmazhat a 50 mikrobiológiában felhasználható egyéb anyagokat is, igy a táptalaj pH-értékének bizonyos értéken való tartásához például krétát, ammóniumsó- és vitaminforrásként szolgáló kukoricaextraktumot, stb. Az emiitett munka-fermentor levegőztető- rr vei, keverővel és a kulturfolyadék pH-értékének automatikus szabályozására szolgáló berendezéssel van felszerelve. A törzset a fermentációs táptalajon 72-96 órán át tenyésztjük állandó keverés és levegőztetés közben 28-35 C°-on. Az L-lizin előállitás intenzivebbé tétele 60 és az eljárás hatásfokának növelése céljából előnyös, ha, /amint a fentiekben már említettük/ a hőmérsékletaránypkat és a levegőztetés intenzitását a törzs tenyésztése során a törzs fejlődési fokától függően /növekedési és bioszintetizáló fok/ változtatjuk. Előnyös,ha a tenyésztést először 24-3° órán át 28-3o C°-on végezzük és a levegőztetés intenzitása óránként 3-4 g 02/Hter, majd a te-65 nyésztést 5o-56 órán át 33-35 C°-on folytatjuk, miközben a levegőztetés intenzitása óránként4,8-6 g 02/liter. Az eljárás befejezése után a folyékony táptalaj L-lizin-tartalma 17,8-5o,3 g/liter /L-lizin-monoklórhidrátra számitva/, ami a fermentációs táptalaj kiindulási szénhidráttartalmára vonatkoztatva 22-39 #. A tenyésztés befejezése után a törzs biomasszáját például szűréssel vagy centrifügálással választjuk el a folyékony táptalajtól. A biomassza elválasztása után kapott nativ oldatból az L-lizint ismert módon különítjük el, például ugy, hogy a nativ oldatot ioncserélő oszlopon bocsajtjuk át, majd az L-lizint vizes ammónia-oldattal eluáljuk, az eluátumot bepároljuk és a kapott etanolos koncentrátumot megsavanyitjuk. Miként emlitettük a fermentációs táptalaj uj alkotórészét, mégpedig az ásványolaj eredetű szénhidrogéneken termelt Candida élesztő hidrolizátumát vagy az L-lizint termelő törzs biomasszájának hidrolizátumát /a biomasszát, amint a fentiekben, emiitettük, a bioszintézis után elválasztjuk a folyékony táptalajtól/ a találmány értelmében egyrészt savas hidrolízissel állithatjuk elő. Ezt az eljárást közelebbről az alábbi módon valósítjuk meg. A poralaku Candida élesztőt vagy a törzs nyers biomasszáját valamely ásványi savban, például kénsavban vagy sósavban szuszpendáljuk. Eközben 1 g kiindulási anyagra számitva célszerűen 3-lo ml 4-8 n ásványi savat használunk és a hidrolizist 2,5-3,5 órán át végezzük 129-132 C° hőmérsékleten. Ilyen körülmények között a mikróbás fehérjékből lecsapódnak a treonin, met ion in és az L-lizint termelő törzsek növekedéséhez szükséges aminosavak. Ezután a hidrolizátumot szobahőmérsékletre hűtjük és 7,0-7,3 pH-érték eléréséig semlegesitjük. A semlegesítéshez például lúgokat, báriumhidroxidot, gázalakú ammóniát vagy ammónia-oldatot használunk. Előnyös, ha a semlegesítéshez ammóniát használunk, mert egyidejűleg ammóniumsó képződik, amelyet a hidrclizátumms1 együtt viszünk be a fermentációs táptalajba. így tehát nincs szükség, hogy ezt az alkotórészt /ammóniumsó/ tiszta anyag alakjában vigyük be a fermentorba, igy az eljárás gazdaságosabb és hatékonyabb. A Candida élesztő hidrolizátumát a leirt savas hidrolízisen kivül a kevésbé hatékony fermentációs hidrolízissel is előállíthatjuk. Ez utóbbi eljárás abban áll, hogy a poralaku élesztő vizes szuszpenzációjához olyan litikus enzimet viszünk be, amelyet önmagában ismert módon az Asp.oryze gombából izoláltunk /lásd a korábban már emiitett disszertációt/ és amely az élesztő sejtfalait és fehérjéit hidrolizálja. A fermentációs hidrolizist előnyösen 26-3o °C-on végezzük 5,o pH-értéken lo-12 órán keresztül. Ezután a hidrolizátumot például sósavval megsavanyitjuk, az eközben keletkező csapadékot szűréssel elválasztjuk és a visszamaradó szürletet használjuk fel a fenmntációs táptalaj alkotórészeként. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. A kiviteli példákban az L-lizin koncentrációját papirkromatográfiás és vékonyrétegkromatográfiás módszerekkel határoztuk meg. 1. példa Homoszerin-hiányos Micrococcus glutamicus 95 L-lizint termelő törzset /deponálási szám B-38, deponálva Intézetünk, a moszkvai összszövetségi Genetikai Kutatóintézet törzsgyüjteményében, amelyet a továbbiakban eredeti orosz rövidítéssel "WNII GENETIKA" néven nevezünk/ termosztátban tenyésztünk 29-3o C°on 24 órán keresztül Hottinger-féle agart vagy hus-pepton-agart tartalmazó ferde agáron. Ezután a törzs sejtjeit 5 ml steril fiziológiás oldattal lemossuk a ferde agárról és l-l ml szuszpenziót 5o ml alábbi összetételű steril oltó-táptalajt tartalmazó 75o ml térfogatú steril lombikba viszünk át: 2