170025. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromycin B antibiotikum és egy új hidrolitikus hatású enzim, valamint ilyen enzimet tartalmazó enzimkészítmények előállítására

170025 9 10 Fermentorba l,5súly% szójalisztet, 0,2 súly% kukoricakivonatot, 1,5-2 súly% mennyiségben ámbrás cet zsírját, 0,8-1,2 súly% takarmányélesztőt (fehérje-vitamin-komplex), 0,2 súly% ammónium-szulfátot, 0,5 súly% nátrium-kloridot, 0,3 súly% kalcium-karbonátot, 1,0-1,5 súly% glükózt tartalmazó, sterilizált táptalajt töltünk. A táptalajt az Actinomyces hygroscopicus VNIIA-997 törzs oltóanyagával oltjuk be, amelyet 1 súly% szójalisztet, 0,2 súly% kukoricakivonatot, 1 súly% ámbrás cet-olajat, 1 súly% száraz takarmányélesztőt, 0,2 súly% ammónium-szulfátot, 0,5 súly% nátrium-kloridot, 0,3 súly% kalcium-karbonátot és 1 súly% glükózt tartalmazó táptalajon 28 C°-on 54 órán át végzett tenyésztés útján kaptunk. A fermentálást 0,3 at nyomáson 1 térfogatmennyiség táptalajra vonatkoztatva percenként egy térfogatmennyiség levegő bevezetése mellett 28 C° hőmérsékleten 168-192 órán át végezzük. A fermentálás után a tenyészetet gyűjtőtartályba vezetjük, a semleges pH körüli pH-értéken a kalciumionok kicsapására nátrium-oxalát oldatával kezeljük, majd a biomasszát és a kalciumsók csapadékát az oldattól elválasztjuk. Az így kapott oldatot - amely 2000-3500 AE/ml Hygromycin B antibiotikumot tartalmaz - az antibiotikum elkülönítésére karboxilcsoportokat tartalmazó kationcserélőgyantával (éspedig közelebbről a Sojuschimreaktív szovjet cég által szállított KB-2 vagy KB-4P-2 típusú gyantával, amelyek metakrilsav- vagy akrilsav-bázisúak) töltött ioncserélőoszlopokból összeállított berendezésbe vezetjük. Az ioncserélőoszlopokon végzett kezelés után kapott, 10-50 AE/ml visszamaradt Hygromycin B antibiotikumot tartalmazó szűrletet keverővel felszerelt tartályban összegyűjtjük, majd az oldat térfogatára vonatkoztatva 50-60%-ban vett ammónium-szulfáttal az oldatból a hygrolytin enzimet kicsapjuk. 6-10 órán át hűtött állapotban végzett kisózás után a csapadékot centrifugán elkülönítjük, majd 0,001 mólos kalcium-klorid-oldatban feloldjuk. A kapott oldathoz hűtés közben azonos mennyiségű hideg acetont adunk, az elegyet további 30 percen át hűtjük, majd centrifugáljuk. Az így elkülönített csapadékot 30 térfogat% aceton és 70 térfogat% víz elegyében feloldjuk, míg a fel nem oldódó részt centrifugálás útján elkülönítjük és eldobjuk. A centrifugálásnál elkülönített folyékony fázishoz hozzáadjuk a 30%-os acetonnal kapott oldatot majd az így kapott elegyhez tízszeres térfogatú hideg acetont adunk hűtés közben. A képződött csapadékot elkülönítjük, kétszer hideg acetonnal mossuk és vákuumban megszárítjuk. A megszárított csapadékot 0,001 mólos kalcium-klorid-oldatban feloldjuk, a kapott oldathoz aktív szenet adunk, majd az elegyet 1,5 órán át keverjük és szűrjük. Ezt követően a szűrletet sterilizáló szűrőn is átszűrjük, majd flakonokba töltjük és liofilizáljuk. Az oldat színtelenítése az előbb említett aktív szenes kezelés helyett végezhető úgy is, hogy az oldatot erősen bázikus anioncserélőn, például 3,0 értékű duzzadási koefficienssel rendelkező anioncserélőn vezetjük keresztül (e célra jól hasznosítható a Pharmatia A.B., Uppsala, svéd cég Sephadex DEAE A—50 típusú terméke, a Sephadex gyanták térhálósított dextránok). 5 A tiszta enzim előállítására a kapott liofilizált port 0,001 mólos kalcium-klorid-oldatban feloldjuk, majd a kapott oldatot az említett típusú Sephadex gyantával vagy más, a szűrőeffektus elve alapján működő szorbeáló anyaggal" töltött oszlopon bo-10 csatjuk keresztül. Ezt a műveleti sort háromszor megismételjük, majd a kísérő ballasztanyagoktól és sóktól megtisztított oldatot a tiszta enzim előállítására liofilizáljuk. A nyers enzimkészítmény (protohygrolytin) elő!5 állítását úgy végezzük, hogy a biomasszától elkülönített oldatot a Hygromycin B antibiotikum elkülönítésére végzett ioncserélőoszlopos kezelés után vákuumban legfeljebb 40 C°-on betöményítjük, majd a kapott koncentrátumot porlasztva szárító 20 berendezésben a szárításhoz alkalmazott levegő Í10-130C°-OS belépési hőmérséklete mellett megszárítjuk. A nyers enzimkészítmény előállítható úgy is, hogy a tenyészetet a biomassza elkülönítése nélkül 25 40 C°-on 30 percen át végzett hőkezelés révén autolízisnek vetjük alá, majd valamelyik említett kationcserélő szuszpendált és mozgatott rétegén vezetjük keresztül a Hygromycin B antibiotikum elkülönítésére és ezt követően betöményítjük, majd 30 megszárítjuk. A tiszta enzim elkülöníthető úgy is, hogy a tenyészetet a biomasszától végzett elválasztása és nátrium-oxaláttal végzett kicsapatás után mefakrilsav-bázisú polimerizációs gyanta típusú (például a 35 Sojuschimreaktív szovjet cég által szállított, hidrogénionokkal töltött állapotú KMT gyanta), legalább 4,0 értékű duzzadási koefficiensű kationcserélővel töltött oszlopon bocsátjuk keresztül, majd az ioncserélőről az enzimet pufferoldattal végzett eluálás 40 útján deszorbeáljuk, és végül a kapott oldatot megszárítjuk. A találmányt közelebbről az alábbi példákkal kívánjuk megvilágítani. 1. példa 10 darab, egyenként 750 ml térfogatú lombikba egyenként bemérünk 50 ml táptalajt, amely 50 l,5súly% szójalisztet, 0,2 súly% kukoricakivonatot, 2 súly% ámbrás cet-olajat, 1 sűly% vízmentes takarmányélesztőt (fehérje-vitamin-komplex), 0,2 súly% ammónium-szulfátot, 0,5 súly% nátrium-kloridot, 0,3 súly% kalcium-karbonátot és 1 súly% glükózt 55 tartalmaz. A táptalajt ezután beoltjuk 10 térfogat% mennyiségben az Actinomyces hygroscopicus VNIIA-997 törzs 149 számú variánsának 48 napos oltóanyagával. Ezt a variánst - miként említettük - úgy kapjuk, hogy az Actinomyces hygros-60 copicus VNIIA-997 törzs tenyészetét 200 000 Röntgen dózisú röntgensugárzásnak tettük ki. A Í49 számú variáns kukoricakivonatot és keményítőt tartalmazó táptalajon gyorsan nő, domború, néha redőzött telepeket képez, amelyek 65 nagysága 6-8 mm. A légmicélium gyengén fejlett, 5