170025. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromycin B antibiotikum és egy új hidrolitikus hatású enzim, valamint ilyen enzimet tartalmazó enzimkészítmények előállítására

11 170025 12 színe szürkésfehér, spórákat alig képez. A szubsztrátmicélium színe sárgásbarna. Ez a variáns a fermentáció során nem termel Hygromyzin B antibiotikumot, míg a hidrolitikus hatású enzimet legfeljebb 22.0 PE/ml dózisban termeli. A fermentáció időtartama 148 óra 28 C° hőmérsékleten, így 500 ml tenyészetet kapunk 20 PE/ml proteolitikus aktivitással. A folyékony tenyészetet ezután Büchner-szűrőn szűrjük, amikor is 420 ml oldatot kapunk, amelyet liofilizálunk. így 16,4g enzimkészítményt kapunk 500 PE/g aktivitással. 2. példa 300 liter térfogatú fermentorba bemérünk az első példában ismertetett összetételű táptalajból 200 litert majd a táptalajt olyan oltóanyaggal oltjuk be, amelyet 1 súly% szójalisztet, 0,2 súly% kukoricaextraktumot, 1 súly% mennyiségben ámbrás cet zsírját, 1 súly% vízmentes takarmányélesztőt (fehérje-vitamin-komplex), 0,2 súly% ammóniumszulfátot, 0,5 súly% nátrium-kloridot, 0,3 súly% kalcium-karbonátot és 1 súly% glükózt tartalmazó táptalajon 28 C° hőmérsékleten Actinomyces hygroscopicus VNIIA—997 54 órán át végzett tenyésztése útján kaptunk. A fermentálást 0,3 at nyomáson és 28 C° hőmérsékleten 180 órán át végezzük 1 térfogategység táptalajra vonatkoztatva 1 térfogategység levegő bevezetése mellett. így 200 liter folyékony tenyészetet kapunk, amelynek aktivitása Hygromyzin B antibiotikumra vonatkoztatva 2420 AE/ml, míg hygrolytin enzimre vonatkoztatva 36 PE/ml. A folyékony tenyészethez ezt követően a kalciumionok kicsapására a pH-érték 7-re való beállítása után 1 kg nátrium-oxalátot adunk, majd a tenyészetet 30 percen át keverjük, és a biomasszát, valamint a kicsapódott kalcium-oxalátot présszűrőn kiszűrjük. A kapott oldatból a Hygromyzin B antibiotikumot a korábban már említett KB-2 típusú kationcserélő szilárd rétegen végzett szűrés útján elkülönítjük. Az ioncserélőoszlopon végzett művelet után kapott 200 liter szűrlethez 25 kg kalcium-kloridot adunk, majd a szűrletet megkeverjük és vákuumbepárlóban 30 C°-on 50 liter térfogatra töményítjük. A kapott koncentrátumhoz keverés közben 1,5 kg nátrium-kloridot adunk, és az így kapott elegyet porlasztva szárító berendezésben a szárító levegő 110C°-os belépési hőmérséklete mellett megszárítjuk. 5 kg protohygrolytin enzimkészítményt kapunk, amelynek aktivitása 240 PE/g. 3. példa A 2. példában ismertetett módon előállított, 200 liter térfogatú folyékony tenyészetet — amely 2600 AE/ml Hygromyzin B antibiotikumot és 36 PE/ml enzimet tartalmaz - 30 percen át 40C°-on tartjuk, majd lehűtjük 10C°-ra és pH 7-nél 1 kg nátrium-oxalátot adunk hozzá. Ezt követően a kapott elegyet 30 percen át keverjük, majd a Hygromycin B antibiotikumot a korábban már említett KB—2 típusú kationcserélő szuszpendált rétegén szűrés útján elkülönítjük. A 2. példával analóg módon 5,4 kg mennyiségben a protohygrolytin enzimkészítményt kapjuk, amelynek aktivitása 200 PE/g. 4, példa A 2. példában ismertetett módon előállított, ion-10 cserélőgyantával töltött oszlopon a Hygromycin B antibiotikumtól elkülönített oldat 20 literjéhez - amelynek pH-értéke 6,8 és proteolitikus aktivitása 33 PE/ml- keverés közben 10 kg ammónium-szulfátot adunk, majd a kapott elegyet hűtőtérben 15 egy éjszakán át 4 C°-on állni hagyjuk. A képződött csapadékot centrifugálás útján elkülönítjük, majd 1 liter 0,001 mólos kalcium-klorid-oldatban feloldjuk. Az így kapott oldathoz hűtés közben 1 liter, 20 0 C°-ra lehűtött acetont adunk, majd a kapott elegyet hűtőtérben 0,5 órán át állni hagyjuk. A képződött csapadékot centrifugálás útján elkülönítjük, majd 300 ml lehűtött 30%-os acetonban feloldjuk, és az oldhatatlan részt elkülönítjük. Az 25 oldhatatlan csapadéktól elkülönített oldathoz 3 liter lehűtött acetont adunk, majd a kivált csapadékot centrifugálás útján elkülönítjük, acetonnal mossuk és vákuumban megszárítjuk. így 30 g nyers terméket kapunk, amelynek aktivitása 7,4PE/mg és 30 fajlagos aktivitása 19,5 PE/mg fehérje. A nyers terméket 3,8 liter 0,001 mólos kaicium-klorid-oldatban feloldjuk, majd a kapott oldat pH-értékének 8,5-re való beállítása után az oldat-35 hoz mosott aktív szenet adunk, az így kapott elegyet 1,5 órán át keverjük, diatomaföld-réteggel ellátott Büchner-szűrőn és ezt követően sterilizáló szűrőn szűrjük. Az így kapott steril oldatot flakonokba töltjük (egy-egy flakonba az oldatból 40 150 ml-t töltünk) és liofilizáljuk. A kapott 18 g steril, hygrolytint tartalamazó gyógyszer aktivitása 8,8 PE/mg és fajlagos aktivitása 23,8 PE/mg fehérje. 45 5. példa A 4. példában ismertetett módon előállított lio-50 filizált készítmény 18 g-ját 80 ml 0,001 mólos kalcium-klorid-oldatban feloldjuk, majd a kapott oldatot Sephadex G—75 márkanevű anyaggal töltött két oszlopon (egy-egy oszlop átmérője 6,0 cm a Sephadex-töltet magassága 50 cm) 140 ml/óra 55 arányban átbocsátjuk. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. így 1,8 g készítményt kapunk 38 PE/mg aktivitással és 42 PE/mg fehérje fajlagos aktivitással. Az így kapott készítményből 1,8 g-ot feloldunk 60 10 ml 0,001 mólos kalcium-klorid-oldatban és a kapott oldatot Sephadex DEAEA-50 márkanevű anyag és Trisz-puffer keverékével töltött oszlopra (átmérője 3,5 cm, a Sephadex-töltet magassága 50 cm) felvisszük. Az eluálást pH 7,0-ra beállított 65 Trisz-pufferrel végezzük. 6